中华医学投稿         医学论文投稿    医学杂志投稿       医学护理论文
      资料与方法
　　在常规试管婴儿体外受精-胚胎移植（IVF-ET）中，每一胚胎移植周期的成功率也只有1/4左右［1］。单纯形态学参数只能粗略地估计胚胎的发育潜能，而80年代初，人们在研究胚胎的形态和着床的关系时发现，人类胚胎的染色体异常可能是影响胚胎着床的重要因素［2］。近年来，在应用荧光原位杂交（FISH）技术，分析植入前胚胎也证实，染色体嵌合型不论在形态正常与否的胚胎中均占有一定的比例［3］。我们从1998年11月开始，应用双色FISH分析胚胎的性染色体，1999年5月开始加用18号染色体探针进行三色荧光原位杂交技术。
　　一、 研究对象
　　取1998年11月～1999年8月，本生殖医学研究中心IVF-ET治疗周期中胚胎质量差、不适于胚胎移植和冷冻保存的正常受精胚胎以及在植入前胚胎性别诊断中，诊断为男性胚胎、不能移植的胚胎共38个为研究对象，在受精后第2～4天进行固定。
　　二、 方法
　　1. 细胞固定：
　　将胚胎置于酸性酞若液内，当透明带被消化后转移到 N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（hepes）缓冲液内，用细管吹打至细胞散开。取单个细胞放在已滴有1 μl Tween-20/盐酸（0.1% Tween-20, 0.01 mol/L盐酸）的玻片上，在解剖镜下观察直至细胞溶解。待玻片干燥后，在磷酸盐缓冲液内洗5 min，然后依次用70%、85%和100%的乙醇脱水。玻片可在-20℃保存［4,5］。
　　2. 对照淋巴细胞的培养：
　　用淋巴细胞行FISH杂交率的对照。将染色体正常的成年男性外周血0.6 ml加入5 ml 淋巴细胞培养液RPMI 1640中，摇匀后置于37℃培养箱中培养66 h。在培养终止前加入秋水仙素（2 μg/ml,0.5 ml），然后用低渗液0.075 mol氯化钾和固定液（甲醇∶冰醋酸为3∶1）处理。最后将细胞悬液滴在清洁的玻片上，镜下观察染色体的分散情况，玻片在-20℃保存。
　　3. FISH:
　　选用美国Vysis公司的染色体计数探针。其中X染色体探针用橙色标记，Y染色体探针用绿色标记，18号染色体探针用绿蓝色标记。变性时将玻片置于73℃ 70%的甲酰氨中5 min，然后加入73℃已变性并混有杂交液的探针。盖上盖玻片后用橡皮水泥封口，37℃杂交炉内杂交2～4 h。杂交完成后，将玻片置于73℃ 0.4×氯化钠/柠檬酸钠缓冲液/0.3%乙基苯基聚乙二醇（0.4×SSC/0.3%Nonidet P-40）中2 min和室温下2×SSC/0.1%Nonidet P-40中1 min洗脱非特异性杂交，最后加入10 μl 4′，6-diamidino-2-plenylindole（DAPI）复染剂复染后在奥林巴斯BX 60荧光显微镜下分别用罗丹明、 异硫氰酸荧光素和Aqua滤片观察结果。
　　4. 结果评定：
　　当细胞同时出现红绿信号各1个和两个绿蓝色信号时，诊断为男性胚胎（XY，1818）。仅当同时出现两个红色和两个绿蓝色信号时，才诊断为女性胚胎（XX，1818）。如果信号有分裂，但两个信号非常接近，互相有交叉或并排排列的两者之间距离小于信号大小的一半时判断为一个信号［6,7］。根据Delhanty等［1］的分类标准，将胚胎分成正常和异常两大类。正常胚胎即全部细胞核均为正常二倍体。异常胚胎再分为“ 嵌合型、异常非嵌合型以及无规律分裂型3类。根据嵌合型胚胎中占主导的细胞为正常二倍体还是其他异常核型，将其再分为二倍体嵌合型和异常嵌合型。
　　三、 统计学方法
　　38个胚胎共有293个核，282个核有杂交信号，杂交率为96.2%。11个核无杂交信号。正常胚胎12个，占31.6%，二倍体胚胎（正常胚胎+二倍体嵌合型胚胎）28个，占73.7%，嵌合型胚胎（二倍体嵌合型胚胎+异常嵌合型胚胎）19个，占50.0%。8个加用18号染色体探针的二倍体嵌合型胚胎中，单倍体/二倍体2个，三倍体/二倍体1个，四倍体/二倍体1个，非整倍体4个，其中单体性1个，染色体不分离3个。3个异常非嵌合型胚胎和4个无规律分裂型胚胎的碎片均≥25.0%。
　　不同分裂期胚胎中，嵌合型胚胎所占比例不同。在≤4细胞期胚胎中，嵌合型胚胎占18.2%，但在5～8细胞期和≥9细胞期胚胎中，嵌合型胚胎的比例分别增至68.4%和50.0%，两者比较，差异有显着性（P＜0.05）。随着分裂次数的增加，二倍体嵌合型胚胎中，嵌合型细胞的比例随着胚胎细胞数目的增加而明显减少（r=0.74，P=0.001）。