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      1 材料与方法
　　1.1 细胞株来源 人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1由香港大学馈赠。
　　1.2 试剂
　　单克隆小鼠抗人TLR3一抗：美国Santa Cruz 生物技术公司；羊抗小鼠IgG荧光二抗（FITC标记）：购自美国KPL生物技术公司；引物：由上海博亚公司合成；Poly（I:C）：美国Sigma生物技术公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 细胞培养
　　TEV-1细胞株接种于细胞培养瓶，用DMEM/F12培养液及10%胎牛血清的混合液4～5ml在培养箱中培养。待80%融合后，吸掉旧培养基，D-Hanks液洗涤细胞1次，0.25%胰蛋白酶消化1～2min，在倒置显微镜下观察，当细胞将分离而呈圆粒状时，立即加入适量含血清的新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。再用吸管反复吹打细胞培养瓶壁使细胞脱落，并把细胞吹散至均匀。然后依1：3的比例转移至新的培养瓶中，以上述条件培养。
　　1.3.2 流式细胞仪检测TLR3蛋白在TEV-1细胞株的表达
　　将TEV-1细胞株种植于7个培养皿中培养，生长至80%融合后换成1ml的optin -MEM培养液培养。6个培养皿中分别加入poly（I:C）12μg、25μg及分别培养12、24、48h，另一培养皿则不加。然后制成细胞悬液，无水乙醇固定，加入50μl 0.2% TritonX100破膜，PBS洗2次。加BSA稀释的单克隆小鼠抗人TLR3一抗100μl，4℃过夜，PBS洗2次。加BSA稀释的羊抗小鼠IgG荧光二抗（FITC标记）100μl，4℃孵育30min，PBS洗2次，标本置流式细胞仪上检测。
　　1.3.3 RT-PCR
　　1.3.3.1 RNA的提取：参照TRIZOL试剂盒（美国GIBCOBRL公司）说明书进行提取RNA。
　　1.3.3.5 琼脂糖凝胶电泳 75V电压下2%琼脂糖凝胶电泳40min，紫外灯下观察条带。
　　1.3.3.6 采用英国UVP公司GDS-8000型全自动凝胶成像分析仪扫描DNA条带灰度值，用软件分析条带灰度比值。
　　1.3.4 免疫细胞化学SP法染色 将盖玻片置于细胞培养皿，将TEV-1细胞株接种于其中，放入细胞培养箱培养进行细胞爬片；取出细胞爬片冰丙酮固定20min，细胞面向上固定于载玻片上；3%H2O2 封闭内源性酶；5%的正常山羊血清封闭；以 1：100浓度稀释的单克隆鼠抗人TLR3一抗湿盒内4℃孵育过夜；苏木素复染后脱水、透明、中性树胶封片。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统拍照。
　　2 结果
　　TLR3 mRNA的表达随刺激时间及剂量的梯度的上升而增加，与刺激前比较，P<0.01（见图1、表2）。1泳道为刺激前结果；2泳道为12μg、12h结果；3泳道为25μg、12h结果；4泳道为12μg、24h结果；5泳道为25μg、24h结果；6泳道为12μg、48h结果；7泳道为25μg、48h结果；M为Marker;530bp为β-actin扩增片段；334bp为TLR3扩增片段图1 TLR3的RT-PCR扩增产物检测结果表2 不同剂量及时间梯度Poly（I:C）刺激TLR3 mRNA在TEV-1细胞株的表达
　　流式细胞仪检测TLR3蛋白的表达，平均荧光强度随刺激时间及剂量的增加而上升，与刺激前比较P< 0.01（见表3）； 而荧光阳性细胞数刺激12h与刺激前比较差异无显着性（P>0.05）；刺激24h、48h随刺激时间及剂量的增加而上升，P<0.05或<0.01（见表4）。免疫细胞化学（SP染色法）显示TLR3定位于TEV-1细胞株的细胞浆（如图2）。