本文是一篇专业的医学论文，主要是关于磷酸肌酸的脑保护作用的探讨，详情请看下面的介绍。

　　研究脑组织代谢旺盛，血流量丰富，因此极易受到缺血缺氧的影响，引起神经细胞功能的损害 。缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是由于脑部血液循环障碍，导致以局部神经功能损伤、缺失为特征的一组疾病。该病死亡率高，并发症和后遗症多，严重危害人类健康，目前仍然缺乏有效的防治措施与理想药物。

　　磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是人体内自有的活性物质，作为体内能量储存和转运的重要载体，为ATP补充能量，维持机体进行正常的活动和代谢 。PCr于1927年由Eggleton于哺乳动物肌肉中分离得到，目前外源性PCr在临床上主要作为心脏病的防治用药之一广泛用于心肌保护，但是其对脑损伤的保护作用以及机制研究鲜见报道。本文主要通过建立小鼠脑缺血与脑缺血再灌注模型以及建立大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞缺氧缺糖损伤模型来研究PCr对脑组织以及神经细胞的保护作用并进行相关机制的探讨。

　　1 材料和方法

　　1．1 药品和试剂PCr注射用无菌粉针剂，内含磷酸肌酸钠1g／支，哈尔滨博莱制药有限公司惠赠(批号070823，纯度>97％)；肌酸由美国MERCK公司生产，纯度≥99％ 。

　　Hyclone胎牛血清、高糖DMEM培养基、二甲基四氮唑蓝(Mrrr)购自Gibco公司；Hyclone马血清购自Thremo公司；连二亚硫酸钠(Na S O )购自天津市化学试剂公司；LDH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；青霉素、链霉素购自大连制药厂；其他试剂均为国产分析纯。

　　1．2 实验对象与仪器动物与细胞株：昆明种小鼠共120只，由大连医科大学动物实验中心提供；大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。仪器：3366型CO 培养箱，Thermo一354酶标仪，XD一101倒置显微镜，80—1型低速离心机。

　　1．3 实验方法

　　1．3．1 脑缺血小鼠生存时间以及脑组织MDA含量的测定：小鼠60只，体重2O～30 g，雌雄各半，随机分为假手术组、模型组及药物组。每组各20只。药物组于造模前5 min缓慢尾静脉推注PCr(10 mL／kg)，假手术组与模型组以同样方法注射同等体积的生理盐水。

　　小鼠腹腔注射25％乌拉坦(1 g／kg)。麻醉后，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉。药物组及模型组双重置线结扎两侧血管，假手术组只在血管下置线并不结扎。缝合皮肤切口，将小鼠置于37℃恒温环境加以护理。观察动物4 h内反应及死亡情况。

　　待小鼠濒死时(小鼠呼吸<5次／min视为濒死)及手术后4 h记录存活时间并在冰浴中活体断头取脑(去除嗅球及小脑组织)，在一70℃冰箱冻存待测。全部实验结束后，在冰浴中用预冷的生理盐水将脑组织配制成20％ 脑匀浆，4 oC 3000 r／min离心5 min，取上清液进行MDA含量测定(硫代巴比妥酸比色法)。

　　1．3．2 脑缺血再灌注小鼠脑组织MDA含量的测定：小鼠60只，体重20～30 g，雌雄各半，随机分为假手术组、模型组以及药物组。每组2O只。小鼠腹腔注射25％ 乌拉坦(1 g／kg)，麻醉后，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉。药物组缓慢尾静脉推注PCr(10 mL／kg)，假手术组与模型组以同样方法注射同等体积的生理盐水。

　　给药后8 min，药物组及模型组分别夹闭两侧颈总动脉，假手术组不夹闭动脉。30 min后取下微型动脉夹，再灌注30 min后立即冰浴中活体断头取脑(去除嗅球及小脑组织)，在一7O℃ 冰箱冻存待测。MDA测定方法同上。

　　1．3．3 PC12细胞缺氧缺糖损伤模型M1Tr和LDH含量测定：PC12细胞用高糖DMEM完全培养基(内含10％ 灭活胎牛血清、5％ 马血清、青霉素／链霉素100 U／mL)置于37 oC，5％CO 饱和湿度培养箱中培养。根据细胞生长情况，2—3 d换培养液1次，待细胞80％ 汇合或接近汇合成片后，用0．05％ 胰蛋白酶消化并用吸管轻轻吹打收集细胞，每周传代2次。

　　取对数生长期PC12细胞，消化离心后用完全培养基重悬，密度为2 X 10 -~／mL，接种于96孔板上。在37℃ ，5％CO 饱和湿度条件下培养24 h，使细胞完全贴壁后，弃去原培养液，用D—Hanks液轻轻荡洗2次。

　　实验分为正常组，缺氧缺糖模型组，药物组(PCr组以及肌酸组)。正常组细胞用含糖Eade’S液(g／L)(NaC1 6．68，KC1 0．04，CaC120．2，MgSO4·7H20 0．2，NaHCO32．2，NaH2PO4。2H2O 0．4，HEPES2．4，葡萄糖0．2，pH 7．4)培养。模型组细胞用含4mmolZL Na：S：0 的无糖Eade’S液(配置方法同上，但不加葡萄糖)进行培养(各损伤小组的Na S 0 的浓度分别为0．5、1、2、4、8 mmol／L)。药物组细胞用含4 mmolZL Na：S O 以及不同浓度药物的无糖Ear．1e’S液进行培养，药物终浓度分别为20、15、10、8、5、1 mmoL／L。将培养板置于5％ CO2、37℃ 培养箱中培养3 h后回收上清液，并加无血清高糖DMEM液100 L／孔，M1Tr(终浓度0．5 mg／mL)10 L／孔，置于37℃ 、5％CO，培养箱内继续培养4 h后，加入三联液(10％SDS，5％异丙醇，0．012 mol／L HC1)100I／孔，待紫色结晶完全溶解后，于全自动酶标仪570 nm波长处测定4值。药物抑制率=( 药物姐一A模型组)／(A正常组一A模型组) ×100％ 。用LDH试齐0盒测定上清液中LDH的释放量，测定方法依照LDH试剂盒说明书上操作，于440 nm处测定A值。LDH含量按公式计算：LDH (U／L)=(A测定一A测定空白)／(A标准一A标准空白) ×2000。

　　1．4 统计学方法每个实验至少重复3次。实验数据以 ±s表示，应用SPSS 13．0分析软件，采用单因素方差分析(One—way ANOVA)进行统计学处理。P<0．05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 PCr对脑缺血小鼠生存时间以及脑组织MDA含量的影响药物组小鼠与模型组小鼠相比存活时间明显延长，脑组织MDA含量下降，其小鼠脑组织MDA水平与模型组相比差异具有显着性意义，P<0．05。

　　2．2 PCr对脑缺血再灌注小鼠脑组织MDA含量的影响如表1所示，在缺血再灌注模型中，药物组小鼠脑组织MDA含量下降，与模型组小鼠脑组织MDA的水平相比差异具有显着性意义，P<0．05。

　　2．3．2 PCr和肌酸对PC12细胞缺氧缺糖损伤的保护作用由表3可见，与模型组比较，PCr和肌酸组随药物浓度的增加，Na S 0 诱导的PC12细胞缺氧缺糖损伤有所减轻，细胞存活率明显提高，受损细胞LDH的释放受到抑制。从药物终浓度为5 mmolfL开始，药物组与模型组相比差异有显着性意义。药物终浓度至10 mmol／L时，对Na S O 诱导产生的缺氧缺糖损伤的保护作用达到高峰，继续增加药物浓度其保护作用没有显着增加。各浓度的PCr与相同浓度的阳性对照药肌酸相比，差异无显着性意义。

　　3 讨论能量代谢障碍是脑缺氧缺血后最早产生的病理生理改变，随后产生大量自由基并引发一系列级联反应，促使神经细胞趋向死亡 。脑组织缺氧缺血时能够产生大量的氧自由基；此外，脑细胞神经元富含对氧自由基敏感的多不饱和脂肪酸而抗氧化的物质相对缺乏，因此极易受到自由基的侵袭伤害 ，以上正是ICVD的发病基础。

　　兴奋性毒素一谷氨酸的过度释放是导致缺血缺氧性脑损伤的重要机制之一。由于谷氨酸是一种兴奋性神经递质，所以过量的情况下作用于NMDA受体和非NMDA受体，可引起细胞内钙超载并激活钙依赖的各种酶，损伤细胞结构；钙超载又会生成大量的ROS，促进细胞膜的脂质过氧化，最终造成神经元退变坏死或迟发性死亡H 。

　　PCr是人体中一种高能储存物质，通过“肌酸穿梭”的机制来完成线粒体氧化磷酸化生成ATP，目前在国内外已被广泛用做心脏病的防治用药之一。脑缺血后，能量衰竭主要表现在高能磷酸化合物ATP、PCr的耗竭上。在缺血缺氧初期，氧化磷酸化不能正常进行，ATP减少，糖无氧酵解的关键酶—— 磷酸果糖激酶会被激活，糖无氧酵解增加，能够补充生成ATP，但是通过这种方式产生的ATP要远远少于氧化磷酸化所生成的ATP，因此最终还是会造成能量代谢紊乱，给组织细胞带来损害。本研究证明在缺血缺氧时，内源性PCr不能满足机体对ATP的需求。

　　在机体内，PCr主要由肌酸经肌酸激酶催化而来。Balestrino M等 发现，肌酸能够有效抑制去极化引起的大鼠脑组织的缺氧缺血损伤，由此可以推测，PCr可能对缺血缺氧的脑组织也具有保护作用。

　　目前，已有一些医护工作者将PCr试用于临床的脑损伤患者，并取得了一些疗效。为了切实检测PCr的脑保护作用，本研究复制了全脑缺血以及脑缺血再灌注小鼠实验模型并进行了脑组织MDA含量的测定。MDA是自由基脂质过氧化作用的终产物，其含量高低可以反映脂质过氧化的水平，间接反映机体细胞受氧自由基损害的程度。实验结果表明，PCr能够显着延长全脑缺血小鼠的生存时间，并降低全脑缺血与脑缺血再灌注小鼠脑内的MDA含量，证明PCr能够通过提高脑内ATP水平，增进缺血缺氧脑内的能量代谢进而阻止自由基的产生，保护脑细胞。

　　本研究利用Na2S O 构建了缺氧缺糖PC12细胞损伤模型。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆的细胞株，细胞膜上有NMDA受体、胆碱能M、N受体等，具有神经内分泌细胞的一般特征，该细胞纯化程度高、生长繁殖快、培养周期短、使用方便、条件易控制并有可传代性，所以可以代替神经细胞广泛应用于神经生理和神经药理学研究。

　　LDH是无氧代谢的标志性酶，广泛存在于各组织的细胞浆内，正常情况下不能通过细胞膜，而当细胞受损或者死亡时，就能够释放到细胞外，细胞的受损程度与细胞培养上清液中的LDH活性成正比 J。故测定培养液中LDH活性是反映细胞损伤的一种敏感且较为简便快捷的指标。

　　本实验采用M1Tr法检测细胞的增殖和存活状态，LDH活性来反映细胞的损伤程度。结果表明：

　　Na S O 引起的PC12细胞缺氧缺糖损伤后细胞活力降低，细胞培养液中LDH含量增加，证明细胞破损严重。本研究发现PCr和肌酸均可显着抑制PC12细胞缺氧缺糖的损伤情况，不同程度地提高受损PC12细胞的存活率并抑制LDH的释放，并在一定范围之内具有剂量依赖性。当药物的浓度达到10 mmol／L时，其抑制率达高峰，在此之后即使继续增大药物浓度，细胞的MTI'值不再增加，培养液上清中的LDH含量也不再明显下降，说明此时药物的保护作用已发挥到最大。因此，本实验中药物的最佳浓度为10 mmoL／L，与以往国外的文献报道一致。本实验结果显示，肌酸的作用效果和PCr相近。由于肌酸是PCr的代谢产物，所以推测PCr的抗氧自由基作用可能与其可以代谢成肌酸有关。

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