HBsAg为乙肝病毒感染的最主要病原学标志和直接证据之一，2008年4月调查显示，我国HB—sAg携带率为7．18%。由于一些乙肝低水平携带者的低抗原量及检测方法学所限等原因易造成HBsAg的漏检和假阳性，如何根据检测方法各自的优势及临床需要来选择经济适用、结果可靠的方法，尤其需引起临床医生和检验工作者的重视。本研究探讨了应用Elecsys HBsAg确证试验在ELISA定性及ECLIA定量试验检测的临界灰区及弱反应性标本的临床价值。
1 材料与方法
1．1 标本来源 所有被检血清标本均来自2011年3月~2013年4月苏北人民医院就诊的门诊和住院患者。
1．2 试剂 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(ELISA法)由英科新创(厦门)科技有限公司生产；Roche Modular E170全自动电化学发光分析仪(电化学发光免疫分析法，ECLIA)，配套HBsAgⅡ试剂、定标1、定标2等均由德国罗氏诊断公司生产；乙型肝炎病毒表面抗原确证试剂及HBsAgⅡ质控品均由德国罗氏诊断公司生产。所有试剂均在有效期内使用。
1．3 仪器及信息系统 瑞士TECAN FreedomEVOlyzerl50全自动酶免分析系统，德国RocheModular El70全自动免疫分析仪，Roche RSA样品前处理系统，北京智方LIS系统及cabas IT3000solution软件系统。
1．4 方法 所有被检测对象抽取空腹静脉血3ml，经Roche RsA前处理系统签收、离心、去除试管盖后由TECAN 全自动酶免仪、Roche ModularE17o全自动免疫分析仪分别对相应样本进行检测分析，并对HBsAg灰区及弱反应性标本进行Elecsys HBsAg确证试验。为使血清样本与确认试剂、质控试剂反应过程条件一致，确证过程Roche Modular El70采取只保留一个检测池，封闭其他三个检测池。
1．5 结果的判断 ELISA法检测HBsAg由TE—CAN 全自动酶免仪自动检测并进行结果判断，0D／CUTOFF~1．0结果为有反应性；OD／CUT—OFF<1．0则无反应性。ECLIA法由Roche Mod—ular El70检测，结果通过Elecsys软件自动比较样本的反应产物产生的光电信号和从抗HBsAg定标液得出的cutoff值判定，≥ 1．0 C0I(cutoff指数)结果为有反应性，<1．0 C0I则无反应性。确证试验的结果分析，需先将拟进行HBsAg确证试验的样本与Elecsys PreciControl HBsAgⅡ阳性2号质控品同时经确证试剂及质控试剂预处理，待充分混匀后15~25℃静置30 min后，由Roche Mod—ular El70全自动免疫分析仪检测COI，在审核检测的有效性条件下(由确证试剂检测的ElecsysPreciControll HBsAgⅡ阳性2号质控品的COI必须小于质控试剂检测的COI 5O )，若经质控试剂检测的标本COl为100 oA，确证试剂检测的标本COI为X ，则结果解释为，X>5O 且质控试剂检测的COI≥O．9确证试验结果为无反应性；X<5O 且质控试剂检测的COI≥0．9确证试验结果为阳性。
1．6 统计学分析应用统计软件包SPSS13．0对相关数据进行统计分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用 。检验，显著性检验水准a=0．05。
2 结果
2．1 将其中145例ELISA 法检出的灰区及弱反应性标本分别进行Elecsys HBsAg定量试验及确证试验，不同OD／CUTOFF值结果阳性率比较。
2．2 ELISA 法定性试验与ECLIA 法定量检测HBsAg结果比较。两种方法检测HBsAg结果差异具有统计学意义(x= 22．586，P<0．01)。
2．3 ELISA 法定性试验与Elecsys HBsAg确证试验检测HBsAg结果比较。两种方法检测HBsAg结果差异具有统计学意义(Z 一25．698，P< 0．01)
3 讨论
3．1 ELISA法具有操作简单、特异度好、成本低等优势，又有较高的灵敏度，但在应用过程中仍然存在着许多难点，必须严格控制分析过程才能保证其检测的质量。首先是存在引起该方法假阳性一些标本因素，如标本凝固不全纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果；严重溶血标本因血红蛋白中含有血红素基团，其具有类过氧化物的活性而造成假阳性结果。其次是操作因素对ELISA结果的影响，洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的一个关键步骤，其目的是去除反应体系中与反应无关的成分、未结合的酶以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质，因而在采用全自动酶免分析系统洗板机洗板时，一定要将板条平放于板架上，保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现花板现象而造成实验失败。目前国内各级医院HBsAg检测以ELISA法最为常用，此法敏感性可达0．7 ng／ml，且成本低廉；EcLIA法是将发光系统与免疫相结合以检测抗原或抗体的方法，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之后的新一代标记免疫技术，其具有操作简便，试剂贮存有效期长、检测速度快、敏感度高(可达0．05ng／m1)、线性范围宽、应用范围广等特点。Elec—sys HBsAg确证试验已作为灰区及弱反应性等标本检测结果的确认，为保证其检测的有效性，受检标本、质控品必须与确证试剂[人血清，抗一HBs(人)> 200 000 IU／L]及质控试剂[人血清，抗一HBs(人)<3 IU／L]分析过程所有反应条件一致。
3．2 本研究应用ELISA法检测了HBsAg OD／CUTOFF 1．0～ 1．99弱反应性标本共54例，经Elecsys HBsAg II定量试验有反应性14例，占25．9%；经Elecsys HBsAg确证试验阳性18例，占33．3%，余36例为假阳性，这可能与试剂盒、标本状态、离心时间、加样时间、洗板和显色等因素有关；而ELISA 法检测HBsAg OD／CUTOFF 2．0以上标本经ECuA法定量及确证试验相符率均为100%。任丽民等 研究ELISA法检出的灰区存在一定数量的假阴性结果，若不顾及灰区的标本就有一定的阳性漏检。因而对于采用ELISA法检出的灰区标本建议用更灵敏的化学发光法再次定量检测，本研究应用ELISA 法检测HBsAg OD／CUTOFF 0．85～0．99之间共35例标本，出现1例OD／CUTOFF一0．98灰区标本，经ElecsysHBsAg 11定量试验及确证试验为阳性。有研究证实单克隆捕捉抗体技术的测定方法不能检测到HBsAg突变的重组株和自然突变株，而多克隆捕捉抗体的检测技术对HBsAg突变株有良好的识别能力，Elecsys HBsAgⅡ定量试验与确证试验采用的就是多克隆抗体，避免HBsAg突变株引起的假阴性。在选择性压力(由抗病毒治疗或免疫系统本身引起)下，病毒可表达多种不同的HBsAg突变株，而一些HBsAg检测试剂可能无法检测到，Roche ECLIA法、Elecsys HBsAgⅡ检测试剂是特别针对检测这些突变株而研发的。
3．3 近年来ECLIA在一些医院已经被用于乙肝患者的血清标志物的检测，是一种灵敏度和可信度较高的分析技术。一些HBsAg COI强反应性标本在临床乙肝诊断、治疗过程中为临床全面了解感染情况提供了量化指标，为临床动态观察病情提供了较大的便利。HBsAg COI临界及弱反应标本已被临床医生及检验人员高度关注，经ElecsysHBsAg 1I确证试验检测后结果成为临床医生评价病情、治疗效果的重要参考依据。经SPSS13．0统计软件包计算ELISA定性试验与ECLIA定量试验、ELISA定性试验与Elecsys HBsAg确证试验检测HBsAg结果差异都具有统计学意义(P<0．01)。因此，我们认为ELISA法检测HBsAg灰区及较低含量的弱反应性标本、可疑或乙肝感染两对半模式不常见的标本需再次用敏感度更高的ECLIA等方法复检以防假阴性或假阳性出现，有条件的实验室经确证试验对上述结果进一步确认。
Roche Modular 170全自动免疫分析仪检测系统具有卓越的高临床灵敏度和特异度，可提高这类乙型肝炎人群的检出率，有利于临床的早期干预，有效阻断输血、器官移植、手术等途径的传播，可准确极早地预测抗病毒治疗应答情况对于优化治疗方案，提高治疗疗效有重要意义，当前随着抗病毒治疗的不断发展和HBsAg定量检测系统的研发改进，HBsAg清除或血清学转换已逐渐成为新的治疗终点，因此HBsAg在抗病毒治疗过程中定量检测的临床意义日益受到重视。
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