研制新的可以封闭CD59补体结合位点的短肽封条医学核心期刊目录2

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　　CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着于细胞膜表面的具有抑制补体效应功能的糖蛋白，通过与C8或C9竞争性结合而抑制膜攻击复合物在细胞膜上的形成，是宿主细胞免受活化的补体攻击的最重要的膜补体调节蛋白(mCRP)。大量研究表明，CD59在许多肿瘤组织中高表达，与肿瘤逃逸密切相关[1～6]。抗mCRP抗体封闭实验显示，CD59是前列腺癌PC3细胞逃避补体攻击的最重要的一种mCRP[7]。这提示我们，肿瘤细胞表面CD59分子补体结合位点的封闭可能会增强补体对肿瘤细胞的杀伤，从而提高肿瘤免疫治疗的疗效。在以前的研究中，我们利用噬菌体肽库成功筛选出了可与人CD59分子高效结合的多条短肽[8]。将筛选得到的这些短肽进行认真地比对分析后，我们把其中出现频率最高的两条序列进行组合，人工合成了一条含22个氨基酸残基的短肽(sp22),实验显示sp22具有促进HeLa细胞凋亡的作用[9]。本研究通过构建高表达CD59分子的前列腺癌PC3细胞株，对照观察sp22和抗CD59单克隆抗体对补体介导的转染细胞溶解影响，希望为研制一种新的可以封闭CD59补体结合位点的短肽封条提供依据。现将结果报告如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂和细胞系
　　DLPMHPMC，委托北京Scilight Biotechnology有限责任公司合成;抗CD59单克隆抗体(H19克隆，BD Biosciences公司产品);FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(中杉金桥公司产品);兔抗PC3细胞多克隆抗体(本教研室按常规方法制备);pIRES 真核表达质粒(Takara公司产品);wCD59pIRES(本教研室构建保存);Lipofectin Reagent(Invitrogen公司产品);RPMI 1640(HyClone公司产品);标准胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品);胰酶(Solarbio公司产品);新鲜人血清(我院附属医院门诊健康查体人员的混合血清);MTT(中国医学科学院血液病研究所科技公司产品);SDS(Sigma公司产品);人前列腺癌PC3细胞(我院病理生理学教研室于晓玲教授惠赠)。
　　1.2 PC3细胞的转染和稳定转染细胞克隆的筛选
　　1.2.1 PC3细胞的培养 PC3细胞用含体积分数0.10胎牛血清、 105 U/L青霉素、105 U/L链霉素的RPMI 1640培养液(完全培养液)在 37 ℃、体积分数0.05 的CO2条件下培养，达到80%～90% 细胞融合度时，用2.5 g/L胰酶消化后传代培养。
　　1.2.2 PC3细胞的转染用2.5 g/L胰酶消化生长状态良好的PC3细胞，用RPMI 1640完全培养液调整细胞密度为2×108/L，加入24孔细胞培养板，每孔0.5 mL，于37 ℃、体积分数0.05 的CO2条件下培养24 h。弃孔内培养液，用RPMI 1640培养液洗2次，然后各加0.4 mL RPMI 1640培养液。按Lipofectin Reagent试剂说明书中的方法分别将 wCD59pIRES和pIRES空质粒转染PC3细胞。
　　1.2.3 G418筛选稳定转染的细胞克隆用含800 mg/L的G418、含体积分数0.10的胎牛血清及105 U/L青链霉素RPMI 1640培养液在 37 ℃、体积分数0.05的 CO2条件下培养筛选转染细胞，隔天换液1次。当单个细胞克隆增殖至数十个细胞时，套取至24孔板中，将G418调整为400 mg/L，继续大量扩增培养。
　　1.3 转染细胞的荧光免疫染色
　　分别取wCD59pIRES和pIRES空质粒转染的wPC3、pPC3细胞以及未作转染的PC3细胞，用pH 7.4的0.01 mol/L PBS洗涤2次，涂片，吹干。用体积分数0.95的乙醇溶液固定5 min，待干。加入1∶1 280稀释的抗人CD59单克隆抗体10 μL(阴性对照加10 μL小鼠IgG2a)，置湿盒中37 ℃孵育45 min;用PBS洗涤3次，每次5 min;加入1∶640稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体10 μL，湿盒中37 ℃继续孵育45 min;用PBS洗涤3次，每次5 min，干后镜检。
　　1.4 补体溶解试验
　　将60%～80%融合度的wPC3细胞用2.5 g/L胰酶消化后，洗涤1次，使用RPMI 1640调节细胞密度为4×109/L，加入到96孔板中，每孔50 μL。sp22组和单抗组每孔各加入不同浓度的sp22或抗CD59单克隆抗体50 μL，终浓度分别为5、10、20、40和80 mg/L，每个浓度各设6个复孔。37 ℃孵育30 min后，每孔加入1∶500稀释的兔抗PC3细胞多克隆抗体和新鲜人血清(终浓度为80 mL/L)各25 μL，37 ℃孵育1 h。每孔各加10 μL浓度为5 g/L的MTT后，37 ℃孵育4 h，然后每孔加入100 g/L SDS0.02 mol/L盐酸混合溶液100 μL，轻轻吹打混匀后，再利用微量振荡器振荡溶解15 min，用酶标仪测定630 nm波长处吸光度值。对照组设6个复孔，不加sp22和抗CD59单克隆抗体(用50 μL RPMI 1640培养液代替);非溶解组设6个复孔，不加兔抗PC3细胞多克隆抗体、抗CD59单克隆抗体和sp22(加75 μL的 RPMI 1640培养液)，余试验条件相同。计算wPC3细胞溶解率(LR)。LR(%)=(非溶解组吸光度均值-试验孔吸光度值)/非溶解组吸光度均值×100%。
　　1.5 统计学处理
　　利用统计软件SSPS 13.0及PPMS 1.5[10]处理实验数据，组间比较采用单因素方差分析。
　　2 结果
　　2.1 荧光免疫组化技术检测细胞表面CD59抗原的表达
　　PC3细胞和pPC3细胞表面的荧光强度较弱,而wPC3细胞则明显增强，说明wPC3细胞内wCD59基因成功转染并顺利表达,高表达CD59分子的前列腺癌PC3细胞株构建成功。
　　2.2 sp22和抗CD59单克隆抗体对补体介导wPC3细胞溶解的影响
　　sp22浓度为5、10、20、40、80 mg/L时wPC3细胞的LR分别为(38.96±1.34)%、(42.11±1.29)%、(49.70±1.82)%、(61.14±1.21)%、(75.07±1.01)%，与对照组的LR(32.47±2.14)%相比较，均有显著性升高(F=719.552，q=12.181～79.942，P<0.05)。
　　抗CD59单克隆抗体组与对照组相比较，除抗CD59单克隆抗体浓度为5 mg/L时wPC3细胞的LR[(33.87±1.43)%]没有明显变化外(q=2.635，P>0.05),抗CD59 单克隆抗体浓度为10、20、40和80 mg/L时，wPC3细胞的LR分别为(37.99±1.07)%、(44.50±1.14)%、(55.43±0.91)%、(68.50±1.00)%,均有显著性升高(q=10.341～67.662，P<0.05)。
　　相同浓度条件下，sp22组wPC3细胞的LR显著高于抗CD59单克隆抗体组(q=7.805～12.280，P<0.05)。
　　3 讨论
　　补体系统在机体抗肿瘤体液免疫机制中占据重要地位，补体激活后既可以通过补体介导的细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞，又可以通过增强细胞介导的杀伤作用和诱导强烈的炎症反应而产生综合的抗肿瘤效果。可是，大量的研究发现，肿瘤会利用多种手段来抵制机体补体系统的攻击，其中肿瘤细胞膜表面补体抑制性调节蛋白CD59的异常表达尤其令人关注。
　　目前已在绝大多数类型的肿瘤组织中发现了CD59的高表达。WATSON等[11]研究结果显示，CD59的表达与结直肠癌的分化程度及病人的生存期显著相关，结直肠癌组织中CD59表达高的病人生存期明显缩短。对已实施根治性手术的前列腺癌病人的追踪研究发现，癌组织中CD59表达高的病人肿瘤复发的概率显著升高[6]。这均预示着CD59与肿瘤细胞逃逸密切相关。对肿瘤细胞上高表达的CD59分子补体结合位点的封闭有望成为一项新的抗肿瘤治疗策略。
　　本研究显示，按照噬菌体肽库筛选出的短肽氨基酸序列合成的sp22，可以显著增强补体对高表达CD59分子的前列腺癌PC3细胞的溶解杀伤，并呈一定的剂量依赖性。抗CD59单克隆抗体分子远大于sp22，从理论上说对于CD59分子活性区域的屏蔽作用应该更大，对CD59分子补体抑制活性的中和作用应该更强，可是实验结果却表明，与相同浓度的抗CD59单克隆抗体相比，sp22却表现出更明显的促溶解作用，其原因很有可能是sp22直接结合了CD59分子的补体结合位点的缘故。是否确是如此，有必要进一步地利用实验加以验证。同时，通过本项研究我们成功构建了高表达人CD59分子的前列腺癌PC3细胞株，这为将来开展以CD59分子为靶点的前列腺癌免疫治疗研究创造了有利条件。

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