利用水迷宫观察Ghrelin和Obestatin对空间学习记忆能力的影响医

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　　Ghrelin是1999年KOJIMA等[1]发现的生长素促分泌素受体1a(GHSR1a)的内源性配体。大量实验表明，Ghrelin具有很强的刺激生长激素释放、促进摄食、减少脂肪分解等作用[2]。由于Ghrelin在机体饥饿状态下主要由胃黏膜泌酸腺A细胞分泌，因此大量实验集中于Ghrelin对摄食的启动作用和能量平衡的调节作用的研究。最近的研究结果表明，脑室和外周给予Ghrelin具有促进正常大鼠学习记忆的能力[3,4]。Obestatin与Ghrein是来源于同一个基因的肽类激素，对它的报道目前有许多争议。ZHANG等[5]指出，大鼠腹腔和脑室内注射Obestatin均可以抑制摄食。但是有研究表明，Ghrelin可借助特殊的转运系统通过血脑脊液屏障，而Obestatin却不能通过该屏障，并且它在血液中很快地被降解[6]。HOLST等[7]甚至认为，Obestatin并非GPR39的配体。GOURCEROL等[8]报道，腹腔内注射Obestatin (30、100、300 mg/kg)并不影响累积摄食量。关于Obestatin对学习记忆能力的影响，VALERIA等[9]通过跳台实验和十字迷宫实验证实，Obestatin有增强记忆和促焦虑的作用。本实验采用双侧海马CA3区微量注射Ghrelin、侧脑室微量注射Obestatin，用水迷宫的方法观察其对大鼠空间学习记忆能力的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物及分组
　　选用健康成年雄性Wistar大鼠48只，体质量为250～280 g，由青岛市药检所提供。置25 ℃室温下，昼夜循环光照，自由饮水。大鼠随机分为6组：对照组1、Ghrelin低剂量组和高剂量组;对照组2、Obestatin 低剂量组和高剂量组，每组8只。
　　1.2 双侧海马侧脑室埋管术
　　术前动物禁食15～20 h，采用80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，肛温维持在(37±1)℃。用耳杠将大鼠头部固定在立体定位仪上，使前后囟位于同一水平。充分暴露颅骨，以牙科钻于颅骨表面双侧海马CA3区(前囟后3.0 mm，正中线旁2.8 mm，埋管深度3.2 mm)和侧脑室(前囟后1.0 mm，正中线旁1.4 mm，埋管深度2.7 mm，参照PaxinosWatson图谱，1998)钻透颅骨，注意切勿损伤大脑皮质，清除硬脑膜后将长14 mm、内径相当于7号针头的不锈钢外套管置入双侧海马CA3区。以502胶和牙托粉固定外套管，外套管内置入内芯，防止堵塞。术后腹腔注射青霉素10万单位一次。分笼饲养5 d，自由饮食进水。
　　1.3 给药方法
　　手术后第6天开始注药，动物在无束缚状态下给药。注药管内径为0.2 mm，CA3区注药深度为3.3 mm，注药时间为2 min，然后停针2 min。侧脑室注药深度为3.8 mm，注药时间2 min，然后停针2 min。对照组1双侧海马微量注射无菌生理盐水各1 μL; Ghrelin 低剂量组大鼠双侧海马微量注射0.03 mmol/L的Ghrelin各1 μL;Ghrelin高剂量组双侧海马微量注射0.3 mmol/L的Ghrelin各1 μL。 Obestatin低剂量组侧脑室微量注射Obestatin为0.03 nmol(5 μL);Obestatin高剂量组侧脑室微量注射Obestatin为0.3 nmol (5 μL);对照组2侧脑室微量注射无菌生理盐水各5 μL。每天注药一次，连续给药5 d。
　　1.4 Morris水迷宫实验
　　用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。实验共历时5 d，测试前1 d让大鼠自由游泳2 min;第1～4天，每天上午10:00～12:00进行训练，以避免日节律差异。每天训练4次，每次训练90 s。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路程、所需时间(潜伏期)。4次训练大鼠分别从4个不同的入水点入水，如果大鼠在90 s内未找到平台，需将其引至平台，并使其在平台上停留30 s。这时潜伏期记为90 s，每次训练间隔30 s，统计4次的潜伏期的平均值。在第5天撤除水中平台，然后在原平台象限的对侧象限，将大鼠面向池壁放入水中，测其在90 s内在各象限的游泳时间、游泳距离及其占总时间、总距离的百分比。
　　1.5 统计学分析
　　应用SPSS 10.0及PPMS 1.5[10]统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。
　　2 结果
　　2.1 Ghrelin的水迷宫实验
　　用药组与对照组大鼠每天双侧海马微量注射Ghrelin和生理盐水20 min后进行水迷宫隐匿平台训练，历时4 d。在训练过程中，大鼠寻找水中隐匿平台所需平均游泳时间和路程潜伏期见图1。从潜伏期变化可见，三组大鼠训练前2 d潜伏期迅速下降，从第3天开始趋于平稳，维持在一较平稳水平。前3 d三组之间时间和路程潜伏期比较，差异无统计学意义。第4天高剂量组的平均时间潜伏期为(9.12±0.93)s，明显低于对照组的(21.02±5.36)s(F=9.31,q=4.08，P<0.05)。高剂量组的游泳总距离为(176.31±15.33)cm，也明显低于对照组的(416.84±105)cm (F=10.18，q=3.98,P<0.05)。第5天撤除水下平台，高剂量组大鼠原平台象限游泳时间占总时间的百分比为(42.65±4.50)%，明显高于对照组的(28.65±3.27)%(F=9.02，q=9.02,P<0.05)。高剂量组大鼠原平台象限游泳距离占总距离的百分比为(38.94±4.39)%，高于对照组的(26.68±2.45)%(F=12.22，q=8.04，P<0.05)。
　　2.2 Obestatin的水迷宫实验
　　用药组与对照组大鼠均每天侧脑室微量注射Obestatin和生理盐水，20 min后进行水迷宫隐匿平台训练，历时4 d。在训练过程中，大鼠寻找水中隐匿平台所需平均游泳时间和路程潜伏期见图2。从潜伏期变化可见，三组大鼠训练前2 d潜伏期迅速下降，从第3天开始趋于平稳，维持在一较平稳水平。前4 d三组之间比较，差异无统计学意义。第5天撤除水下平台，三组大鼠在各象限游泳时间及游泳距离占总时间、总距离的百分比各组之间也无统计学意义。
　　3 讨论
　　海马是大脑内侧颞叶的主要结构，与人陈述性记忆的形成关系密切。啮齿类动物的海马是空间学习的必需结构，Morris水迷宫任务与空间学习直接相关; 海马在接受高频传入冲动时突触效能发生改变，如长时程增强(LTP);当动物处于新的环境中时，海马个别的锥体细胞因位置改变而特异性放电。CARLINI等[3]研究显示，侧脑室注射Ghrelin引起焦虑并促进记忆。我们推测Ghrelin很可能通过海马部位起作用，所以选择把Ghrelin注射到海马。实验中双侧海马微量注射Ghrelin对正常成年大鼠的空间学习和记忆有改善作用，表现在隐匿平台实验中，高剂量组的游泳时间和路程都明显低于对照组。空间搜索实验中,高剂量组在原平台象限的游泳时间、距离占总时间、总距离的百分比都明显高于对照组。这与CARLINI等脑室注射Ghrelin通过跳台实验所得的结论一致，而且本实验是将Ghrelin直接注射到海马部位，说明Ghrelin可以通过海马的神经环路发挥作用。
　　Ghrelin影响记忆的确切机制并不完全清楚。原位杂交技术表明除了下丘脑外，海马CA1区、CA3区和齿状回中均存在GHSR mRNA[11];外周注射131I标记的Ghrelin表明，除下丘脑、皮质外，海马CA1、CA3区及齿状回均有Ghrelin的结合位点。所以，Ghrelin很可能与海马区的GHSR结合提高大鼠的学习记忆能力。DIANO[4]通过形态学和电生理等技术证实，外周的Ghrelin可明显提高海马CA1区树棘突密度，增强LTP效应，所以Ghrelin很可能是通过提高树棘突密度和增强LTP效应来影响学习记忆的。
　　本文Obestatin的水迷宫实验结果并没有显示出它可以提高大鼠的学习记忆能力。这与CARLINI等的报道不相符合。可能的原因是CARLINI采用的是跳台实验，它是揭示动物记住某一行为的不良后果，在下次行动时有所犹豫，这主要反映了动物的非陈述性记忆。而我们的水迷宫实验主要反映动物的空间学习记忆能力，可能因为实验方法的不同而产生了不同的结果。另外，从Obestatin的生物学活性和受体方面考虑，它不能通过血脑脊液屏障，并且它在血液中很快被降解, 受体也不能确定是GPR39, 所以Obestatin是否可以增强学习记忆能力有待进一步讨论。

利用水迷宫观察Ghrelin和Obestatin对空间学习记忆能力的影响 医

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