研究金针菇多糖对小白鼠急性肝损伤的作用-医学杂志核心期刊

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　　金针菇（Flammulina velutipes）属担子菌亚门、金钱菌属，是一种食药兼用菌，含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、朴菇素等多种生物活性物质[1]，具有较高的药用价值[2,3]。金针菇功能蛋白性蛋白诸如核糖体失活蛋白（robosome inactitating proteins,RIP）具有抗肿瘤、抗病毒、抗虫、抗真菌以及抗人免疫缺陷病毒（HIV）等活性；
　　真菌免疫调节蛋白（fungal immunomodulatory proteins,FIP）具有抗癌、抗过敏、抗增殖、刺激免疫细胞产生多种细胞因子和免疫调节功能；金针菇毒素（flammutoxin,FTX）具有引起哺乳动物红细胞裂解，使肿瘤细胞溶胀破裂，改变肠上皮细胞的渗透性，促进药物吸收等作用[4-8]。
　　近年来，金针菇中另一种重要的生物活性物质即金针菇多糖（polysaccharides of Flammulina velutipes,FVP）也引起人们的关注。研究发现，金针菇多糖有抗肿瘤[9-11]、免疫调节[12,13]和一定的保肝作用[14，15]。CCl4是一种常见的环境污染源和肝脏毒性物质，CCl4肝损伤是经典的急性化学性肝损伤动物模型，也是目前肝病研究的重要模型之一。本实验通过建立CCl4小鼠急性肝损伤模型，进一步探讨金针菇多糖对肝损伤的保护作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 药物与试剂金针菇多糖（FVP）提取物由广州农业科学院提供；联苯双酯滴丸（BDP），广州星群药业股份有限公司，生产批号：EF40131;谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为：20070713，20070713，20080513，20080513。
　　1.2 动物昆明种小鼠，雄性，体质量（20±2） g,由南方医科大学动物中心提供，合格证号： SCXK（粤）20032002，饲养温度（23±2） ℃，饲养1周后进行实验。
　　1.3 仪器 318K型台式高速离心机（Sartorius,Germany）；MK3型酶标仪（Labsystem,Helsinki,Finland）；BS210S电子分析天平（Sartorius,Gttingen,Germany）；WH861型漩涡混合器（太仓市科教器材厂）；pH S25型酸度计（上海伟业仪器厂）；ULTRATURRAX T8型组织匀浆机（IKA Labortechnik,Staufen,Germany）；WH861型漩涡混合器（太仓市科教器材厂）。
　　1.4 方法
　　1.4.1 CCl4急性肝损伤的造模时间将小鼠随机分成5组，每组10只，分别为：正常对照组、急性肝损伤组1（造模时间为12 h）、急性肝损伤组2（造模时间为24 h）、急性肝损伤组3（造模时间为48 h）、急性肝损伤组4（造模时间为72 h）。各急性肝损伤组均腹腔注射CCl4橄榄油溶液（0.5%,5 mL·kg-1），并分别于造模后12 h、24 h、48 h、72 h乙醚麻醉并心脏取血。正常对照组则腹腔注射等体积的橄榄油后乙醚麻醉取血。用赖氏法测定血浆ALT水平，对比各时间点ALT值随时间的变化关系以确定最佳造模时间。
　　1.4.2 小鼠急性肝损伤模型的建立将小鼠随机分成6组，每组10只：正常对照组、模型组、阳性药组（联苯双酯150 mg·kg-1）、低剂量组（75 mg·kg-1）、中剂量组（150 mg·kg-1）、高剂量组（300 mg·kg-1）。除空白对照组外，其余各组均每日灌胃1次，连续8 d，第7天下午模型组和给药组腹腔注射CCl4橄榄油溶液（0.5%,5 mL·kg-1），正常对照组则灌胃给同等体积蒸馏水和腹腔注射同等体积橄榄油。在造模期间，所有小鼠禁食不禁水。24 h后乙醚麻醉小鼠心脏取血和剥离肝脏。
　　1.4.3 血浆ALT和AST活性的测定小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5 000 r/min离心5 min分离血浆。采用赖氏法[16],按照ALT试剂盒说明书中的步骤进行操作测定血浆ALT活性。
　　1.4.4 肝脏SOD活性的测定小鼠肝组织的5%生理盐水匀浆液在4 ℃条件下以10 000 r/min离心10 min,取上清液稀释成体积分数为2%后以考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。采用黄嘌呤氧化酶法[17]，按照SOD试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝匀浆中SOD的活性。
　　1.4.5 肝组织MDA含量的测定小鼠肝组织的5%生理盐水匀浆液在4 ℃条件下以10 000 r/min离心10 min,取上清液稀释成体积分数为2%后以考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。采用TBARS比色法[18],按照MDA试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝组织匀浆中MDA的含量。
　　1.5 统计学处理实验数据以（±s）表示，采用SPSS软件，利用ANOVA检验进行统计学处理，P< 0. 05有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 CCl4急性肝损伤的造模时间如表1所示，与正常对照组ALT （29.67±1.25） U·L-1相比，小鼠腹腔注射CCl4橄榄油溶液后，血浆ALT值随造模时间的变化而变化（12 h、24 h、48 h、72 h），其中造模24 h后ALT达最高值（117.87±11.86）U·L-1，而12 h和48 h （78.21±9.78,94.55±4.57） U·L-1相对正常组有升高，但比24 h低，72 h后ALT（40.01±9.12） U·L-1趋近正常小鼠血清ALT。
　　2.2 金针菇多糖对急性肝损伤小鼠血浆ALT和AST的影响如表2所示，与正常对照组相比，模型组小鼠血浆ALT和AST水平显着升高（P< 0.01），表明CCl4成功诱导了小鼠急性肝损伤。阳性药组和FVP各剂量组较模型组相比均有显着降低（P< .01），且呈剂量依赖性关系。
　　2.3 金针菇多糖对急性肝损伤小鼠肝组织中SOD活性的影响如表3所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝匀浆中SOD活性显着降低（P< 0.01）。与模型组相比，阳性药组和FVP各剂量组肝匀浆中SOD活性显着升高。
　　金针菇多糖对急性肝损伤小鼠肝组织中MDA含量的影响如表3所示，与正常对照组相比，MDA含量显着增加（P< 0.01）。与模型组相比，阳性药组和FVP各剂量组肝匀浆中MDA含量显着降低（P< 0.01），且呈剂量依赖性关系。表1 CCl4造模后血清ALT在不同时间点的变化表2 FVP对急性肝损伤小鼠血浆ALT和AST的影响与正常对照组比较： ##P<0.01;与模型组比较： *P<0.05，**P<0.01表3 FVP对急性肝损伤小鼠肝组织SOD活性和MDA含量的影响与正常对照组比较： ##P<0.01;与模型组比较：**P<0.01、