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　　1  材料与仪器
　　清洁级雄性SD大鼠50只， 体质量180～220g（徐州医学院实验动物中心）。STZ（美国Sigma公司），灵芝多糖（河北保定施达科生物工程技术有限公司，批号：RM051215）。一抗分别为兔抗大鼠TGF-β1、CO-Ⅳ抗体、SP-6001试剂盒及DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），Total RNA提取试剂、RT-PCR 试剂盒（大连宝生物有限公司）。LEICA Qwin图像处理与分析系统（德国）， 罗氏血糖仪（上海罗氏公司），日立7600型全自动生化分析仪检测（日本日立公司）。
　　2  方法
　　2.1  糖尿病模型的建立和实验分组  将50只SD大鼠随机分为：正常对照组（C组，n＝10），糖尿病组未治疗组（DM组，n＝10），灵芝多糖低剂量组（GLP-1组，n＝10），灵芝多糖中剂量组（GLP-2组，n＝10），灵芝多糖高剂量组（GLP-3组，n＝10），分笼饲养。DM组和GLP-1、GLP-2、GLP-3组大鼠在禁食12 h后，于左下腹腔一次性注射STZ（溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH 4.4）60 mg/kg，72 h后，尾静脉采血测随机血糖≥16.7 mmol/L，持续3 d以上作为模型纳入本实验。C组仅予以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。40只大鼠经检测均造模成功。模型成立3 d后GLP-1、GLP-2、GLP-3组分别给予灵芝多糖水溶液100，200，400 mg/kg剂量进行治疗性灌胃，C组和DM组用等体积生理盐水灌胃。所有大鼠实验期间自由饮水进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。每隔1周测量体质量（Body Weight，BW）以调整用药量。
　　2.2   标本收集连续观察 8周后收集标本。代谢笼中收集24 h尿，离心保存于－20℃的冰箱待测尿微量白蛋白（UAER）。称量体质量后，用10％水合氯醛麻醉，腹主动脉采血测血糖（BG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）。用4℃冰冷生理盐水灌洗后摘除双肾，去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾，左肾重（KW）和体质量的比值作为肾脏指数（KI）的指标。取肾皮质置于10％中性福尔马林中固定，以备光镜、免疫组织化学研究；余肾皮质置DEPC水处理过的EP管，液氮冻透后保存于-70℃的冰箱待测RT-PCR。
　　2.3  生化指标的测定BG采用葡萄糖氧化酶法检测，UAER采用胶体金双抗体夹心法检测，HbA1c采用亲和层析法检测，BUN、Scr、TC、TG由日立7600型全自动生化分析仪检测。
　　2.4   常规光镜检测肾组织经10％福尔马林固定，常规脱水、包埋，切片厚4um，行HE染色和免疫组化。
　　2.5  免疫组化研究采用SP二步法，石蜡切片厚4 μm后常规脱蜡至水，3％H2O2阻断内源性过氧化物酶后，微波加热暴露抗原， 滴加一抗TGF-β1（1∶100）、CO-Ⅳ（1∶120），4℃冰箱过夜，PBS洗片后滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB显色控制在3～5 min，复染、脱水、透明、封片。以吸光度值（A）表示，显色强度用LEICA Qwin图像处理与分析系统进行分析，以每张切片随机取10个视野的肾小球进行半定量分析。
　　2.6   RT-PCR研究由基因库分别查得大鼠TGF-β1、CO-Ⅳ及β-actin的mRNA核苷酸序列，PCR引物用Primer Premier引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（见表1）。取肾皮质100 mg，加液氮研碎后，用Trizol （大连宝生物工程有限公司）提取总RNA。提取的总RNA测OD值：OD260/OD280值在1.8～2.0之间。分别取1 μg总RNA以AMV l （大连宝生物工程有限公司）为逆转录酶作逆转录反应，cDNA产物保存于- 20℃。优化PCR扩增条件，使PCR扩增在对数期内进行。分别进行TGF-β1 、CO-Ⅳ与β-actin 扩增。在DNA扩增仪（Eppendorf Mastercyler gradient） 上进行PCR扩增。TGF-β1 的反应参数为94℃ 2 min，94℃ 45 s、62℃ 45 s、72 ℃45 s共35个循环；CO-Ⅳ的反应参数94℃ 2 min，94℃ 45 s、64℃ 45 s、72℃ 45 s共35个循环；β-actin反应参数为94℃ 2 min，94℃ 45 s、57℃ 45 s、72℃ 45 s共35个循环。取PCR扩增产物5μl在1.5%琼脂糖中电泳，Imagemaster VDS 成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件（TotallabV 1. 01） 行灰度扫描分析。以目的基因与β-actin 的PCR产物条带灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。
　　3  结果
　　本实验结果表明STZ诱导的糖尿病大鼠模型，8周后大鼠出现毛色无光泽、生长发育迟缓等症状，BG、KI、HbA1c、UAER显着升高，病理上肾小球系膜细胞显着增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭窄，提示已出现DN早期表现。GLP给药8周后糖尿病大鼠BW增加、KI降低，UAER指标明显改善，肾脏病理损害得到不同程度的改善，呈现剂量依赖趋势，尤以灵芝多糖高剂量组明显。但对BUN、Scr、TC、TG无影响，这可能与糖尿病大鼠模型时间较短，尚未出现全面的代谢紊乱有关。