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1 材料与方法
　　1.1 研究对象
　　1.1.1 免疫组化
　　选取我院病理科保存的2004-2009年宫颈癌变相关组织石蜡标本136例，患者年龄23～68岁，平均（42.56±8.20）岁。依据病理表现分四组，即慢性宫颈炎组15例、CINⅠ组17例、CINⅡ～Ⅲ组25例、宫颈癌组79例。所有标本均由≥2名的病理学专家再次阅片确诊。选定的石蜡标本均经中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。
　　1.1.2 实时荧光定量RT-PCR
　　经伦理委员会批准并取得患者知情同意后，选取2008年10月-2009年10月在我院行宫颈活检或子宫切除术的患者作为本研究对象。所有患者术前均未接受放、化疗或手术治疗。所取新鲜组织标本大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm，液氮保存备用。最后根据病理结果纳入慢性宫颈炎组10例、CINⅠ组8例、CINⅡ～Ⅲ组9例、宫颈癌组8例，共35例，年龄26～57岁，中位年龄37岁。阳性对照为卵巢癌1例，年龄55岁。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 免疫组化SP法检测Id-1蛋白的表达
　　（1）一抗Id-1兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组化SP超敏试剂盒为天津津脉基因测绘技术有限公司产品。具体实验步骤按照说明书进行。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，阳性对照由Santa Cruz公司提供。（2）采用Olympus光学显微镜观察各试验组宫颈组织中Id-1表达情况，由2名试验人员双盲法独立分别对试验结果进行半定量评分，最终结果取均值或协商确定。Id-1免疫组化阳性着色主要定位于胞浆，为棕黄色或棕褐色。根据着色深浅和阳性细胞比例对免疫组化结果进行半定量评分，确定表达强度分级。具体评分标准见参考文献[2]。
　　1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测Id-1 mRNA的表达
　　（1）Trizol提取组织总RNA，-70℃保存备用。（2）Id-1和β-actin基因引物和TaqMan探针由TaKaRa公司合成，见表1。（3）Id-1基因为单外显子，逆转录前用DNA酶处理。按照Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（立陶宛MBI 公司）说明书进行操作，逆转录获得cDNA。逆转录条件为20℃ 10min → 42℃ 60min → 70℃ 10min，-20℃保存备用。（4）标准曲线的制备：用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，自每个稀释模板中取样2μl，分别加入30μl的反应体系中行实时荧光定量RT-PCR。扩增条件为94℃预变性2min;94℃ 20s，54℃（Id-1）/52℃（β-actin）20s，60℃ 30s，45个循环；最后60℃延伸5min。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期，在该时相读取Ct值。（5）待测样本目的基因相对拷贝数的测定：将逆转录得到的cDNA样品各取2μl，加入和上面完全相同的反应体系，在同样的反应条件下行PCR扩增，测定各样品的Ct值，采用比较阈值法计算目的基因拷贝数=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（CtId-1-Ctβ-actin）试验组-（CtId-1-Ctβ-actin）参照组。本研究目的基因为Id-1，管家基因为β-actin，参照组为慢性宫颈炎组。2-ΔΔCt表示的是试验组目的基因的表达相对于参照组的变化倍数。表1 Id-1和β-actin基因引物及探针序列
　　2 结果
　　慢性宫颈炎组织中未见Id-1蛋白阳性表达，而宫颈癌及癌前病变组织中均有不同程度的Id-1免疫阳性反应，主要定位于细胞质，表现为棕黄色或黄色颗粒样物质。Id-1表达阳性率随宫颈癌病变程度的加重而升高，在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1阳性表达率分别为0、11.8%、40.0%和74.7%，差异有统计学意义（χ2=45.017，P=0.000）。
　　对36例组织标本进行实时荧光定量RT-PCR检测，得标准曲线回归系数均>0.96，标准曲线拟合满意。Id-1基因扩增效率为1.97，β-actin为1.99。可见，目的基因与管家基因的扩增效率基本相同，故可采用比较阈值法计算Id-1基因拷贝数。CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组织中Id-1 mRNA的相对表达量分别为慢性宫颈炎组的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差异有统计学意义（P=0.003），Id-1基因表达在宫颈癌组高于癌前病变组（P<0.05），而在慢性宫颈炎组织中的表达低于宫颈癌（P=0.031）和CINⅡ～Ⅲ组织（P=0.045）。