喹诺酮类药物作为广谱抗菌药物临床应用十分广泛，由此带来的耐药问题也日益严重。以往的观点认为，喹诺酮耐药主要由于细菌染色体上药物靶蛋白的突变造成。但近年来发现了质粒介导的喹诺酮耐药机制，包括qnr基因、氨基糖苷乙酰转移酶变体aac(6)一Ib-cr和外排泵基因qepA，这些机制虽然只能引起低水平的喹诺酮耐药，却有利于细菌筛选出染色体突变的高水平耐药株。这些基因可以通过质粒接合、转座等途径和其他常位于质粒上的耐药基因，特别是8内酰胺酶基因同时快速传播，给临床用药带来了巨大威胁。本研究对临床上分离的1株弗劳地枸橼酸杆菌中发现的新质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrB24(该基因已经在GenBank注册，注册号：HM192542)做了克隆表达。
材料与方法
一、材料
(一)菌株来源 1株临床分离的弗劳地枸橼酸杆菌(编号：906546)于2009年7月7日分离自本院外科病区1例66岁男性患者的中段尿标本。
(二)抗菌药物 E试验纸条法中环丙沙星、左氧氟沙星纸条均购自瑞典AB BIOMERIEUX公司。
(三)qnrB引物共用2对qnrB引物，引物序列见表1。
(四)试剂Taq酶、dNTP、10 X buffer、DNAmarker购自大连宝生物公司，PCR引物由上海生物工程有限公司合成，连接试剂盒购自大连宝生物公司。MH 琼脂购自英国OXOID公司。
(五)表达载体和受体菌pHSG398质粒：带有氯霉素抗性基因。受体菌E．coil JM109购自北京原平皓公司。
二、方法
(一)细菌鉴定 菌株由MicroScan walk—AWay一40全自动微生物分析仪鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。
(二)药敏试验方法 临床菌株、受体菌及表达株对氟喹诺酮类药物敏感性的判断采用E试验纸条法。药敏结果判断采用2010年CLSI标准。
(三)表达载体的构建 ①PCR产物的双酶切；②载体质粒pHSG398双酶切；③PCR产物与载体质粒pHSG398的连接。
(四)转化 转化采用氯化钙共沉淀法，使用的试剂以及操作方法按文献进行。
结 果
一、qnrB24基因的检测及qnrB24基因突变氨基酸序列1株弗劳地枸橼酸杆菌携带qnrB24基因，qnrB24基因PCR 阳性结果见图1。qnrB24与qnrBlO同源性为98．7% ，共6个碱基位点发生变化，42位T—A，139位C—A，257位C—T，643位C—T，670位A—G，672位T—G。其中3个氨基酸位点发生改变，47位亮氨酸一蛋氨酸，86位丙氨酸一缬氨酸，224位异亮氨酸一缬氨酸。有义突变位点见。
二、qnrB24基因的克隆表达qnrB24基因在E．coil JM109受体菌中克隆表达，经BamHI DNA 内切酶和EcoRI DNA 内切酶双酶切检测，对重组质粒进行了DNA测序分析，证实表达成功。结果见图三、临床菌株、受体菌和表达菌株的MIC值携带qnrB24基因表达株对左氧氟沙星、环丙沙星敏感性较受体菌E．coil I，M109下降为原来的1／8，但耐药水平仅为临床分离菌株1／32～1／128倍。
讨 论自1998年，Martinez-Martinez等 在1株肺炎克雷伯菌临床分离株中发现1个可介导喹诺酮类耐药的质粒pMG252，该质粒上的喹诺酮类耐药基因被命名为“qnr”，即后来的“qnrA”。后来发现该质粒能增加该菌对其他抗菌药物的多重耐药抵抗，同时也大幅度地增加了对喹诺酮类抗菌药物的耐药性，尽管这种耐药水平没达到临床喹诺酮耐药的标准，但这个质粒却能选择出高水平的喹诺酮耐药。
临床也发现，携带qnr基因的敏感的肠杆菌科细菌在体外很容易发生染色体突变和对喹诺酮类药物高水平耐药。如果含qnr基因的菌株在人群中广泛传播，一旦暴露在喹诺酮药物作用下，很快就会发展为耐药菌株。Hata等在福氏志贺菌临床分离株中发现了qnrS基因。Jacoby等_7]又在肺炎克雷伯菌中发现了qnrB基因，qnrB1与q rA、qnrS之间的同源性分别为39．5%和37．5%。这些基因各自编码的蛋白同属于五肽重复家族。随后qnrC、qnrD也陆续被发现，qnrC基因与qnrA1、qnrB1、qnrS1、qnrD分别有64%、42%、59%、43%同源性，qnrD基因与qnrA1、qnrBl、qnrS1分别有48%、61%、41%的同源性。
目前，在亚洲的东部和南部，美国和欧洲的南部和北部陆续发现qnr基因E4A03。对qnrA基因的研究表明，该基因位于In4家族的I类整合子上 ，它编码的蛋白能够逆转喹诺酮类对DNA旋转酶的抑制作用，从而引起细菌对喹诺酮类药物的低水平耐药。同时，qnr基因的存在还能促进染色体gyrA、gyrB、parC、pare基因耐药决定突变区(QRDRs)的变异，导致高水平耐药。目前，携带有qnr基因的质粒已经紧密联系着其他抗生素的耐药，特别是B内酰胺类，氨基糖苷类药物。
最近报道qnrA基因经常和G内酰胺酶在同一个整合子上传播，经常同时携带的β内酰胺酶包括CTX—M 一9 、CTX—M一14E、FO)，-5 E、SHV一5E、SHV一7E18_、SHV一12 E21 或VEB一1，而携带qnrB基因的质粒通常也携带有CTX—M一15、SHV-12l7
或SHV-30E20,22基因。最近在海洋生物的染色体上发现qnr3、0RF513、ORF1005和一些非耐药基因同时存在。Corkill等发现qnrB在I类整合子上，该整合子上常携带有其他的耐药基因。因此，可将qnr基因及其他耐药基因在不同的细菌间直接传播整合。
本研究首次发现了1株弗劳地枸橼酸杆菌携带qnrB基因新的突变体，已命名为qnrB24。虽然qnrB基因的流行率相对较低，但qnrB能介导细菌对喹诺酮低水平耐药，容易发展成高水平耐药，因此还需要监测该耐药基因在细菌中的流行性。本次克隆表达结果显示，临床菌株对左氧氟沙星、环丙沙星的MIC值普遍高于表达株，表达株的耐药性明显高于受体菌，说明qnrB24基因单独作用能导致细菌对喹诺酮类药物耐药性增高，但对喹诺酮类抗菌药物靶位点的保护作用相对比较低，临床菌株的耐药性是qnrB24基因与其他因素共同作用的结果。与qnrB22、qnrB23相比较，qnrB24转化子对喹诺酮类药物敏感性较qnrB22、qnrB23转化子有所降低。
因此认为qnrB基因能降低细菌对喹诺酮类药物的敏感性，但各种qnrB基因亚型之间使细菌敏感性的降低程度可能不同。今后拟对qnrB24质粒作进一步分析，了解该质粒有无与其他耐药基因共同传播
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