从基因水平探讨糖尿病血管增殖性病变的发病机制省级医学核心期

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　　文献报道，人糖尿病血管增殖性病变的发生与CD59糖基化失活有关[1]。与动物不同，人CD59具有独特的糖基化位点K41～H44，已证实K41(赖氨酸)的糖基化可损害CD59的活性。因此，我们认为糖尿病病人体内可能存在易于糖基化的突变CD59分子。为了探讨人突变CD59的抗补体活性及其与糖尿病血管并发症之间的关系，本研究拟采用PCR定点诱变法获得糖基化位点改变的目的CD59突变基因，将其转染CHO细胞，获得阳性表达克隆，为从基因水平探讨糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　大肠杆菌DH5α由本室保存。CHO细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。含人突变CD59 cDNA重组pALTERMAX载体(HM7、HM8)由高美华教授在美国哈佛大学制备。pcDNA3 质粒购自美国Invitrogen公司。EcoRI、 DNA marker DL 2000购自宝生物工程(大连)有限公司。F12培养液、RPMI1640购自Hyclone公司。2.5 g/L的胰蛋白酶、G418购自Amresco公司，CD59FITC、荧光抗体鼠(MOUSE)IgG2aFITC购自COULTER公司。辣根酶标记兔抗山羊IgG(H+L)购自北京中山生物技术有限公司。抗CD59(N20)抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。
　　1.2 扩增含人突变CD59 cDNA重组HM7、HM8质粒
　　HM7、HM8质粒分别转化大肠杆菌DH5α后经氨苄青霉素筛选，均参照《分子克隆》方法提取质粒。提取的质粒用EcoRⅠ酶切鉴定，得到含有目的基因片段的重组质粒。行DNA序列分析。
　　1.3 重组质粒转染CHO细胞
　　运用阳离子脂质体介导pcDNA3、pALTER质粒共转染CHO细胞。转化前1 d用2.5 g/L的胰蛋白酶消化CHO细胞,计数，按每孔1.5×105个细胞接种至24孔培养板。每孔加入不含抗生素的F12培养液0.5 mL,使转化当天细胞长满单层。分别取HM7pALTER、HM8pALTER、pALTER质粒各2 μL分别入3个转化管, 每管加入pcDNA3 0.8 μL,稀释于50 μL不含牛血清及抗生素的F12培养液中，标记为A管。分别在3个空转化管中加入2.5 μL的Lipfectamine 2000,再加不含牛血清及抗生素的F12培养液50 μL,室温放置5 min，标记为B管;对应的B管与A管混合,室温放置20 min。取出24孔板,每孔用2 mL无血清F12培养液洗2次后,加入0.4 mL无血清F12培养液。将上述混合液加到24孔培养板中,轻轻摇动混匀，于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养4 h后,每孔加0.5 mL含体积分数0.20牛血清的F12培养液,于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养。24 h后,去除脂质体DNA原培养基,加入胰蛋白酶消化后,加入2 mL含体积分数0.20的牛血清及100 kU/L青、链霉素的F12培养液,轻柔吹打使细胞混悬，细胞混悬液按1 500、400、200 μL分别加入若干单孔培养板，然后每个板中加入 10 mL含体积分数0.20的牛血清及100 kU/L青、链霉素的F12培养液, 于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养。
　　1.4 筛选稳定转染的阳性克隆
　　培养48 h后,换用筛选液(含400 mg/L G418, 体积分数0.20的牛血清,100 kU/L青霉素、链霉素的F12培养液), 于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养,筛选13 d。当阳性克隆长至细胞数达数十个后,用高压消毒的TIP头的环状尾部套取阳性单克隆,接种至24孔板中培养。选取生长状态良好者大量扩增培养。
　　1.5 突变基因表达蛋白的检测
　　应用酶免疫组织化学法(EIH)[2]及流式细胞术(FACS)[3]检测突变基因蛋白的的表达。
　　2 结果
　　2.1 重组质粒的酶切鉴定
　　pALTER质粒长5 533 bp，插入基因片段长为495 bp(人CD59基因309 bp+flag 24 bp+前导序列75 bp+酶切位点)，所以重组质粒基因长约6 kb，EcoRⅠ酶切重组质粒可得到一约500 bp的片段。10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物与预期一致(图1)，说明重组质粒构建成功。
　　2.2 阳离子脂质体共转染CHO细胞阳性克隆的筛选
　　重组质粒与pcDNA3用Lipofectamine 2000共转染CHO细胞，转染48 h后加入致死量的G418 400～800 mg/L，发现大量细胞从瓶壁脱落、裂解、死亡，只有少数细胞存活，筛选约13 d后可见生长状态良好的细胞克隆。
　　2.3 突变基因蛋白的表达
　　2.3.1 EIH检测显微镜下观察，阳性细胞被染成棕褐色，而空质粒转染的细胞染色浅。
　　2.3.2 FACS测定每个样本均设同型对照(鼠IgG2aFITC)和阴性对照(不加荧光抗体)，以排除细胞自身的非特异性荧光的干扰。结果显示，HM7质粒在CHO细胞表达率为68.6%，HM8质粒在CHO细胞表达率为71.7%，提示重组质粒成功转染入CHO细胞。
　　3 讨论
　　CD59 是一种广泛分布于组织细胞表面的GPI锚固糖蛋白,具有多种重要的免疫功能[4]。作为补体系统终末阶段的调节蛋白,CD59以同源限制的方式抑制攻膜复合体(MAC)的生成,保护自身正常组织细胞免受补体损伤。近年来研究显示，糖尿病人的血管内皮细胞及肾脏MAC沉积增多，导致从MAC靶定的内膜释放生长因子，如基底成纤维生长因子和血小板源性生长因子等[4]，而生长因子的释放可以刺激血管壁细胞增殖并可导致增殖性血管并发症的发生。人CD59作为补体调节分子，可以抑制MAC的形成，从而抑制由于MAC插入内皮细胞促使生长因子释放而导致的血管增殖性并发症的发生。但糖尿病病人的持续高糖血症可使CD59发生非酶糖化并损伤其功能，因此糖尿病血管增殖性病变的发生与CD59糖基化失活可能有关。人CD59的NMR结构显示，易于糖基化的氨基或靠近咪唑基团，或为赖氨酸双体结构，因此，离咪唑基团约0.5 nm的氨基基团最容易糖基化[5,6]。CD59糖基化位点位于K41和H44， K41与H44D1咪唑氮的距离约(0.59±0.14)nm，且靠近活性位点W40，而H44具有协助K41 糖基化作用，已证实K41的糖基化可能防碍CD59的活性[3]。如果缩小赖氨酸与组氨酸的距离，或同时增加了赖氨酸的数量，理论上将使赖氨酸更易糖基化。因此，我们认为糖尿病病人体内可能存在两种易糖基化的CD59突变基因，一种为HM7，即42位苯丙氨酸、43位谷氨酸均突变为赖氨酸，缩小了赖氨酸与组氨酸的距离，同时增加了赖氨酸的数量;另一种为HM8，即43位谷氨酸突变为赖氨酸，缩小了赖氨酸与组氨酸的距离。这两种突变基因在理论上均更易糖基化。
　　有研究显示，可溶性CD59在原核细胞中可以获得表达[6]，但活性较低。本课题转染选用的CHO细胞是目前公认的较理想的一种哺乳动物表达系统。CHO细胞易培养和产业化，表达的蛋白质具有良好的天然构象，遗传稳定性好，表达效率高。
　　pALTER可在大肠杆菌中大量复制，也可在哺乳动物细胞中高效表达。其多克隆位点两端分别有T3、T7启动子，可直接用于测序。HMpALTER重组表达质粒含有人突变基因CD59的全长cDNA序列，保证了表达产物具有较好的天然构象，利于活性研究，也为后继抗体的制备奠定了基础。
　　将外源DNA或质粒导入真核细胞的方法有生化法、物理法、病毒介导转染法，目前常采用脂质体法。脂质体转染所需DNA的用量少，转染效率高，转染快速。我们选用阳离子脂质体作为转染试剂，在优化条件下将阳离子脂质体试剂和重组质粒混合，可将重组质粒转入CHO细胞内。但pALTER质粒缺少药物抗性的筛选标记基因，故多采用和pcDNA3共转染。pcDNA3可在哺乳动物细胞中高效表达，同时还具有氨苄青霉素和新霉素(G418)抗性基因，有利于质粒转染细胞后阳性克隆的筛选。
　　本文将携带突变人CD59基因的质粒稳定转染CHO细胞，从而获得突变CD59表达细胞株，EIH及FACS证实了CHO细胞高效表达人突变CD59基因。我们将进一步对突变CD59的补体限制活性进行研究，并利用高效表达的细胞制备特异的单克隆抗体，为从基因水平探讨糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定基础。

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