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　　1  材料
　　1.1   药物提取
　　取植物虎眼万年青，在自然条件下干燥，粉碎成粉。加入95%的乙醇浸泡24 h，纱布、滤纸过滤后，收集滤液，滤渣继续加入乙醇浸泡，同上方法循环 3次，收集滤液，将3次所得滤液合并。滤液经减压浓缩为原来体积的1/5，再用1/3体积的石油醚萃取脱脂，保留水相，再次减压蒸馏后，加水稀释上AB-8柱吸附，反复吸附3次，6～8倍柱体积水洗掉糖后用5倍柱体积95％乙醇洗脱皂苷。所得皂苷洗脱液，经D-280柱脱色后，减压浓缩后蒸干，即为虎眼万年青总皂苷。
　　1.2  实验动物及设计
　　雄性Wistar清洁级大鼠30只，体质量130～150 g，购自延边大学医学部实验动物中心。动物适应3 d后开始实验。正常组：整个实验过程中均饮用灭菌自来水及基础饲料，并于18周末宰杀6只。模型组：每日给予基础饲料同时，用灭菌自来水配制浓度为95 μg/ml的二乙基亚硝胺（DEN）溶液（美国Sigma公司，避光保存，新鲜配制），供大鼠自由饮用，每天更换1次。连续饮用4周后，改饮一般的灭菌自来水4周，再继续饮含95 μg/ml的DEN溶液。并分别于饲养第14周末、18周末分别宰杀各6只。肝硬化预防组：于实验开始在肝癌模型建立的同时， 根据预实验小鼠虎眼万年青总皂苷的LD50为3.2g/kg, 以接近于LD50之1/30的剂量，即相当于100mg/kg的给药浓度，以蒸馏水制成所需浓度的混悬液，每日灌胃并于14周末宰杀6只。肝癌治疗组：第14周后从模型组中随机选出6只，按模型组饲养同时给予虎眼万年青总皂苷100mg/kg，并于第18周末宰杀。
　　1.3  取材及处理
　　各组大鼠宰杀前禁食12h，称体质量，乙醚麻醉后， 解剖腹腔，取肝组织，出现癌灶者取肉眼癌结节及距癌灶边缘0.5～1cm癌旁组织约50～100mg样品，生理盐水冲洗，液氮快速冷冻，并置-70℃冰箱，待统一检测。
　　1.4  试剂及器材
　　TRIZOL试剂、无RNA酶的水、无RNA酶的糖原（Invitrogen life technologies）；氯仿、异丙醇、100%乙醇、乙酸钠、甲醛（上海化学试剂有限公司）；Tris-HCl、EDTA 、MOPS、溴化乙锭、2.5 mM dNTP混合液、100 bp DNA Ladder；RNA酶抑制剂；MMLV反转录酶；5xRT缓冲液。DK-8D型电热恒温水槽；Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems）；FeroTec Gradien PCR基因扩增仪；DYY-8型稳压稳流电泳；H6-1微型电泳槽；ABI 7700 Realtime PCR仪（ABI）；引物设计软件：Primer 5.0。
　　2 方法
　　2.1  样品的RNA抽提
　　①每50～100 mg组织样品，加入1 ml的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆。②匀浆后样品于15～30℃孵育5 min。每1 ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15 s后，15到30℃孵育2～3 min。4℃下12 000 r·min-1离心15 min。③将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1 ml TRIZOL试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30°C孵育10 min后，于4℃12 000 r·min-1离心10 min。④移去上清液，每毫升TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃ 7 500 r·min-1离心5 min。⑤去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5～10 min，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10 min。获得的RNA溶液保存于-70℃。
　　2.2   使用样品的RNA进行cDNA合成
　　2.2.1  配制退火混合物RNA 2 μg，0.5 μg/μl Oligo（dT）18 1μl，加无RNA酶的H2O至总体积 10 μl混合液在70℃水浴3 min,降到37℃放置10 min。
　　2.2.2  RT反应液（5xRT缓冲液4μl，2.5mmol/L dNTP混合液4μl，RNA酶抑制剂1 μl，MMLV反转录酶1 μl，混合后37℃恒温1 min）。
　　2.2.3  加10 μl的RT反应液到10 μl退火混合物中，37℃水浴60 min，加热到95℃维持5 min。得RT终溶液即cDNA溶液，置冰浴待用。
　　2.3  合成的cDNA用于实时定量PCR
　　2.3.1   制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板
　　针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应：dNTP（2.5 mmol/L each）（2.5 μl）；10 × PCR缓冲液（2.5 μl）；MgCl2 溶液（1.5 μl）；Taq聚合酶（1U）；10 μmol的PCR特异引物F（1 μl）；10 μmol的PCR特异引物R（1 μl）；cDNA（1 μl）；加水至总体积为25 μl。轻弹管底将溶液混合，40个PCR循环（94℃，20 s；退火温度，20 s；72℃，30 s）；72℃延伸5 min。
　　将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定standard1的浓度为106，standard 2的浓度为105 ，standard 3的浓度为104，standard 4的浓度为103，standard 5的浓度为102，standard 6的浓度为10，standard 7的浓度为1。见图1。
　　2.3.2  进行Realtime PCR反应
　　几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：dNTP（2.5mM each）（2.5μl）；10x PCR缓冲液（2.5 μl）MgCl2 溶液（1.5 μl）；Taq聚合酶（1units）；Sybergreen（终浓度0.25×）；50X  Rox（0.5 μl）；10 μmol/L的PCR特异引物F（1μl）；10 μmol/L的PCR特异引物R（1 μl）；cDNA or DNA（1 μl）；加水至总体积为25 μl。轻弹管底将溶液混合，5000 r/min短暂离心。
　　3  结果
　　各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。实时定量PCR时各样品加样量均为1 μl，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1 μl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因beta-actin作为内参，以样品待测基因得值除以此样品内参值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。