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1材料
　　Wistar大鼠，雄性，体质量150～250 g（军事医学科学院第四研究所动物实验中心），L-DMEM培养基（美国GIBCO公司），胎牛血清（FCS，美国Hyclone公司），胰蛋白酶（Difco），乙二胺四乙酸（EDTA，天津联星试剂公司），BrdU （Sigma公司），CD44、CD34免疫组化试剂盒（天津联星试剂公司），BrdU石蜡切片免疫组化试剂，VEGF免疫试剂盒及ELISA试剂盒，中药心复康。
　　2 方法
　　2.1  BMSCs体外分离培养和BrdU标记本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选法培养并纯化BMSCs，大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量D-Hank's液冲洗骨髓，100目筛网过滤，采用Percoll分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，将密度为1.073 g/ml的Percoll预先置于试管的底部，然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液，1 800 r/min离心20 min,收获位于界面层灰白色的单个核细胞，用L-DMEM离心洗涤2次，800 r/min离心5 min。以3.0×105/cm2的密度接种于L-DMEM完全培养液，置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中继续培养，48 h后首次换液，以后每隔3 d更换1次培养液，2周后细胞长满80%瓶底。
　　骨髓间充质干细胞的传代培养：将原代细胞瓶内的培养液弃去，D-Hank's液冲洗2次，以去除培养液中的血清，加入2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L乙二胺四乙酸消化细胞，显微镜下观察，控制消化时间。细胞收缩变圆时，立即加入含少量血清的培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，收集细胞悬液，800 r/min离心5 min,弃上清。加入完全培养液充分吹打成单细胞悬液，按1∶3传代接种于75 cm2培养瓶内，待细胞铺满瓶底后依上法传代。
　　骨髓间充质干细胞的鉴定：选用生长状况良好的骨髓间充质干细胞，采用SABC法检测细胞表面抗原CD44+、CD34-的细胞即为所需细胞，实验发现第3代获得BMSCs的纯度超过95%［3，4］，实验用第3代细胞。
　　BrdU标记：每日观察原代及传代的细胞生长状况，需加BrdU的培养瓶中预先加入0.5 cm×1.0 cm无菌玻片，当细胞铺满瓶底50%时加入BrdU溶液10 μmol/L（BrdU 50 mg;二甲基亚砜0.8 ml;水1.2 ml）分别孵育24，48，72，96 h。取出玻片，用PBS冲洗，4%多聚甲醛固定15 min,进行Brdu免疫组化染色（严格按试剂盒说明进行）。
　　2.2  动物模型制备
　　同基因型雄性Wistar 大鼠，190～210 g，乙醚吸入麻醉。颈部正中切口，插入气管套管，行呼气末正压通气，标准肢体II导联记录心电图。在胸部左侧约0.5 cm处第4、5肋间切开皮肤，钝性剥离肌肉层，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm处用无创小圆针结扎左冠状动脉前降支。手术15 min，心电图S-T段呈单向曲线，术后两周HE染色见明确梗塞区示手术成功。
　　2.3 BMSCs移植移植前
　　48 h在培养液中加入终浓度为10 μmol/L 的 5-溴脱氧尿核苷（Brdu）对移植细胞进行标记。胰酶消化，PBS反复冲洗、离心（1 500 r/min，5 min ）2 次，加入 PBS 液调整细胞浓度为2×106/ml。治疗组手术结扎冠状动脉15 min后，再次打开胸腔，暴露心脏，用结核菌素注射器吸取1 ml细胞悬液，分别于结扎区和附近心肌组织分5点注射细胞，对照组和模型组注射相同剂量生理盐水，注射完毕后，关闭胸腔，并注射两天青霉素。
　　2.4 动物分组实验分为4组：假手术组（S组，n=10），只开胸穿线，不结扎左冠状动脉前降支；模型组（AMI组，n=10）：开胸结扎左冠状动脉前降支；单纯细胞移植组（B组，n=10）：手术后15 min，注射培养的BMSCs；中药联合细胞移植组（X+B组，n=10）：手术后15 min移植培养的BMSCs，并按体表面积法计算中药剂量的10倍（81 g·kg-1·d-1）灌胃2周。
　　2.5 中药制备将中药心复康（由西洋参、白术、枸杞子、女贞子、土鳖虫等组成）置于砂锅中，加入相当于药材体积5倍的自来水浸泡1～2 h，煮沸30 min，滤过药液，再加入3倍量的自来水继续煮沸20 min，过滤，合并两次滤液，将药物浓缩至200 ml备用。
　　2.6 指标检测
　　2.6.1 血清血管内皮生长因子（VEGF）的检测术后2周大鼠眼眶后静脉丛采血2 ml，室温静置20 min，3 000 r/min离心10 min，离心半径为15 cm，小心吸取血清置-70℃冰箱保存待测。以酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定，严格按试剂盒说明进行，以pg/ml表示血清VEGF含量。
　　2.6.2  血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达用病理图像分析仪测VEGF平均光密度指标判定标准：心肌组织中VEGF表达：以心肌细胞胞浆内或细胞外基质出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。免疫组化阳性反应强度，用图像分析系统进行定量分析。阳性反应强度用IOD值表示， IOD值=阳性反应面积/平均光密度。
　　2.6.3  移植细胞存活率和心肌微血管密度检测处死动物，以结扎线为标志，每隔3 mm取大鼠心脏横断面，每只大鼠心脏取材3块组织，制成切片，免疫组织化学方法检测心梗区Brdu阳性移植细胞数和CD34+新生血管数（操作按试剂盒说明进行）。Nikon光学显微镜400×视野下，每个组织切片随机选取10个视野，分别计算BrdU阳性移植细胞数和CD34阳性的血管数量，取10个视野平均值。相互分离的内皮细胞、内皮细胞簇、内皮细胞条索均按1个微血管计数，管腔大于8个红细胞大小，且带有较厚肌层的血管则不予计数。
　　3 结果
　　 BMSCs分离和培养分离接种的细胞镜下呈圆形，大小不一，数目较多，48 h后贴壁，8～9 d后大部分细胞变成长梭形，少部分呈多角形。此期的细胞生长迅速，互相连接。传代培养2～3代后，细胞形态变得较为一致，呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，集落之间相互靠近，融合后呈漩涡状。至培养的第12天左右细胞达到80%～90%融合，此时已传至第3代，细胞形态成较一致的长梭形。将此时的细胞收集用于细胞移植实验（见图1～3）。
　　 BMSCs标记骨髓间充质细胞培养至40％～50％贴壁时加BrdU，在培养过程中，BMSCs呈纺锤形，可以贴壁生长、增殖。第8天，培养瓶中几乎所有的细胞都呈纺锤形的间充质干细胞。各标记组均见BrdU阳性细胞， BrdU阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥漫性分布。标记组可见BrdU标记的细胞。未标记对照组未见阳性细胞。各组观察200个细胞，记录BrdU阳性细胞的数目。结果可见标记24，48，72 h各组之间细胞阳性数明显增加，我们选用标记72 h作为最佳标记时间进行后续试验，标记率>96%,能够满足实验需要。