同种异体带瓣管道(valved homograft conduit，VHC)即一段带有主动脉瓣或肺动脉瓣的大动脉，通常由生前无大血管病、瓣膜病、感染性疾病或自身免疫病的脑死亡患者自愿捐献，因其具有正常的生理功能、解剖形态及生物活性等诸多优点，广泛应用于治疗婴幼儿复杂型先天性心脏病及成人大血管病，并取得良好的临床疗效，其保存方法也相应的成为研究热点。经过40余年的发展，VHC的保存方法不断推陈出新，笔者就VHC保存方法的发展史、现状及进展做一简要综述。

　　1 VHO保存方法的发展VHC的保存方法的发展大致可以分为四个阶段：第一阶段(2O世纪6O年代中期)即原位移植法，将无菌条件下获取的新鲜VHC于数小时内用于手术治疗；第二阶段(60年代中期～70年代中期)，利用化学试剂或放射线进行灭菌，低温冻干保存，由于在灭菌的同时使同种异体带瓣管也丧失生物活性，术后瓣膜容易退变、钙化，远期效果不佳；第三阶段(70年代中期～80年代中期)，将取下的VHC置于抗生素液中灭菌24 h，然后置于含低浓度抗生素的营养液中4℃低温保存，保留了生物活性[3]，其临床近、远期效果尚可，但保存时间最长仅6周，仍不理想；第四阶段(8O年代中期以后)，应用抗生素灭菌、控制速率降温、液氮深低温保存的方法。目前国际上应用最为广泛，研究最多的就是此法。其主要过程是将取下的VHC置入37℃抗生素液中灭菌24 h，随后将VHC置于含有冷冻保护剂二甲基亚砜(DMS0)的RPMI 1640 培养基中，以一1℃／min的速度控制性降温至一8O℃ ，再转入液氮中深低温保存，深低温保存的VHC寿命长达半年以k 引。2 VHC保存方法的现状及进展VHC的生物活性及组织结构的完整性是保存其功能的关键。VHC的生物活性是指其所含有的活细胞数量及功能状态，而组织结构的完整性，是指细胞外基质的成分和结构的完整性。目前VHC保存方法的研究进展主要集中在供者条件、热缺血时间(warm ischemia time，WIT)、灭菌方法、冷冻方法、复温方法等方面。

　　2．1 供者条件 供者自身健康情况是决定VHC的生物活性及组织结构的完整性的基础条件。Sad—owski等于临床应用中发现，取自高龄供者的带瓣管道，瓣膜易发生蜕变及关闭不全等并发症。

　　Verghese等指出，来源于器官或组织移植术后个体的VHC容易诱发受体免疫应答，不宜作为供体。

　　Gall等利用薄层放射自显影技术定量评价了有心跳供者及心跳停止供者的VHC采集后的最初活性，结果取自有心跳供者的VHC的最初活性(92±2) 明显高于取自心跳停止供者的VHC的最初活性(66±3) ，提示心跳停止后，由于VHC缺乏氧气及营养物质供应，生物活性明显下降。因此，为了尽可能的保留VHC的移植前活性，应在供者心跳停止后尽快采集。目前在临床应用中，供者一般选择45岁以下，生前无大血管病、瓣膜病、感染性疾病及自身免疫病的脑死亡患者，于严格无菌条件下取出VHC，放入含抗生素的生理盐水或Hank S液中，无菌袋包装两层，在4℃条件下尽快运送至瓣膜室进行修剪和后续处理。

　　2．2 wIT WIT是指VHC从心脏停搏失去血液供应到被取下处于0～4℃ 保存之间的这段时间。

　　Mohan等研究发现，当wIT >24 h，VHC的血管内皮细胞基本死亡、脱落，前列环素的合成停止，动脉壁内的胶原纤维也受到损伤，结构的完整性已受破坏 。Suh等研究了不同wIT下猪主动脉瓣瓣膜成纤维细胞的活性，在热缺血2 h后成纤维细胞的活性为(92．25±2．7) ，24 h后为(57．0±10)％(P<0．05)，提示随着wIT延长，成纤维细胞活性明显下降口 。Burkert等应用扫描电子显微镜观察不同wIT对人主动脉瓣的影响，当wIT在常温下达12 h，瓣膜内皮细胞间连续性中断，部分内皮细胞向腔内突出，并出现内皮细胞脱落；当wIT达48 h，内皮细胞完全脱落，管壁结构同时受损，通过对wIT不同的带瓣管道的损伤程度进行比较提出，wIT应尽量控制在24 h之内。Stemper等研究发现，即使4℃保存超过24 h，血管组织力学较新鲜血管也明显下降。以上研究为临床上将带瓣管道的wIT 控制在24 h内提供了客观的实验依据。

　　2．3 灭菌方法 经典的抗生素液配方采用青霉素50 U／mL、链霉素50 ug／mL、二性霉素B10g／mL，其效果确切。但Strickett等研究发现，二性霉素B及链霉素有较强的细胞毒性，可使瓣膜成纤维细胞活性明显下降l1 。余海彬等在VHC的灭菌处理中采用头孢西丁240 mg／L、多黏菌素B100 mg／L、林可霉素120 mg／L、万古霉素50 mg／L的配方r1 ，在保证灭菌效果的同时，又避免了链霉素及二性霉素B对细胞活性的影响。Jashari等研究发现去除头孢西丁，使用更低浓度的林可霉素、多黏菌素B、万古霉素对细胞活性无明显影响，同时灭菌效果肯定。因抗生素主要是在细菌的繁殖期杀菌，故在37℃ 条件下能发挥抗生素的最大灭菌活性。但常温下，瓣膜组织保持正常代谢速率不可避免地会出现因缺氧及营养不足导致瓣膜组织细胞失活。4℃ 孵育灭菌的方案最早由Kinklin提出，Fan等研究发现，4℃低温条件下灭菌20h，瓣膜的代谢速率减慢，对氧气及营养物质缺乏的耐受能力增强，但灭菌效果肯定。

　　2．4 冷冻方法 目前临床上主要采用的是O Brien提出的应用抗生素液孵育灭菌、控制速率降温、液氮深低温保存的方法。其主要机制是深低温环境可中断细胞的代谢，抑制机体的生化活动。Brock—bank等对不同方法保存的VHC成纤维细胞的蛋白质合成功能进行了比较，液氮深低温保存组2年后成纤维细胞仍具有蛋白质合成功能，低温冻干组成纤维细胞的蛋白质合成功能随时间进行性下降，4℃保存组2周后的成纤维细胞蛋白质合成功能仅为液氮保存组的15 l1引。提示液氮深低温保存能有效保护细胞功能。

　　液氮深低温保存法能有效保存组织器官，但仍存在冷冻损伤。二甲基亚砜(DMSO)是VHC液氮深低温保存时最常用的冷冻保护剂，它能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。但高浓度的DMSO本身具有细胞毒性并可导致渗透损伤，目前认为DMSO在冻存液中的最佳浓度为15 口 。Wusteman等研究发现，在冻存液中用维生素B复合体取代钠盐可阻止DMSO 发挥其毒性作用 。Mazur等研究发现，在快速冷冻时，细胞内液中的水分子来不及渗透至细胞外而在细胞内形成冰晶，损伤细胞超微结构，导致细胞死亡。而慢速冷冻时，细胞在高渗状态的细胞外液和有毒性的防冻剂中暴露时间过长，也可导致细胞死亡[2 。因此，降温速率的快慢对保存细胞生物活性至关重要。利用程控降温仪控制VHC以较为稳定的合理的速度降温，能尽可能减少冷冻损伤。VanDerKamp 等研究发现，一1℃／min是最佳降温速度，能最大限度的保存VHC成纤维细胞的活性_2引，此观点目前已被广泛接受。

　　近年来，在程序降温过程中，相变点这一概念越来越受到重视。所谓相变点是在冷冻过程中，样品由液态转为固态发生形态转变的温度点，样品在发生形态转变的过程中会释放出大量的融合热，可以导致局部样品凝结后温度回升融解，随后再次凝结。在这一过程中，细胞易反复受到冰晶损伤，影响VHC的保存效果。为了克服相变热，在接近相变点时加大降温速率，使VHC温度不回升，在完全相变后再降低降温速率，继续以一1℃／min降温，可减轻VHC的损伤。杜月河等报道，人同种异体主动脉带瓣管道的相变点在一4～ 一6℃ ，在此期间加大降温速率至一4℃／min比一1℃／min降温能有效减轻细胞的损伤_2 。

　　2．5 复温方法 经液氮深低温保存的VHC需解冻复苏后方可用于临床。目前，42℃水浴快速复温在临床上受到普遍认同。快速复温对快速冷冻的细胞尤为重要，对于细胞内有冰晶形成的细胞，通过快速复温可以限制细胞内迁移性再结晶现象，减少因反复结晶而对细胞造成损伤，从而提高细胞成活率，达到细胞保护的作用 。因DMSO在常温下对细胞具有毒性作用，当带瓣管道复温融解后，应迅速将其取出，应用“等级系列漂洗法”将DMSO从细胞内置换出来，从而保证VHC的生物活性。

　　3 同种异体带瓣管道研究的热点

　　3．1 VHC的免疫学研究 既往多数学者认为，液氮深低温保存的VHC不具有免疫原性或免疫原性较弱。近年来国外部分研究表明，液氮深低温保存后的VHC确实具有免疫原性。Brockbank等研究发现，免疫排斥是引发VHC远期钙化、衰败的主要原因。Baskett等亦指出，这种现象在婴幼儿中更加明显，受体与供体之间HLA配型及血型的不匹配可能是引发婴幼儿术后VHC早期失功的主要原因。因此，降低或消除VHC 的免疫原性，VHC术后的免疫排斥反应的监测、抑制，对保证术后远期效果有着重要意义。

　　3．2 VHC的组织工程学研究 随着组织工程学的兴起，对VHC进行组织程化改造成为可能。

　　VHC携带有供者的内皮细胞及成纤维细胞具有一定的免疫原性，可引发受者产生慢性排斥反应，造成VHC远期钙化、衰坏。通过对VHC进行去细胞化，同时保留瓣膜、管壁的完整性r2 ，在体外利用组织工程学技术采用受者内皮细胞对其进行再内皮化 ，生物相容性良好、无免疫原性，同时保留了VHC的结构、生理功能，有望减轻移植术后的免疫排斥反应及远期的钙化、衰坏，被认为具有很大的潜力。

　　3．3 VHC冷冻方法的研究 VHC最常用的保存方法即液氮深低温保存法。该法虽然效果肯定，但仍存在一定的冷冻损伤，其机制包括冰晶体机械作用、致盐变性、渗压溶解、冷冻生物应力等。近年来，一种名为玻璃化冷冻法的快速冷冻法逐渐兴起，其基本原理是采用高浓度冷冻保护剂及单步快速降温，使溶液连续性的固化为无定型的玻璃态，防止细胞内外的冰晶形成，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布，避免了挤压损伤和冻融效应，从而减少细胞、组织的损伤口 。我国学者吴富章等及马广仁等先后报告将玻璃化冷冻法应用于保存家兔肌腱及股动脉，效果均优于液氮深低温保存法，通过进一步实验和改进，该法将来有望应用于VHC的保存。

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