鼻咽癌是我国南方和东南亚地区高发的头颈部恶性肿瘤，其对药物治疗敏感性的降低，严重影响肿瘤的治疗效果及预后，因此，探讨鼻咽癌对药物治疗敏感性的分子机制，寻找新的治疗靶点，对提高临床药物治疗的疗效有着重要的意义。氯喹(chloroquine，CQ)常用于治疗疟疾、自身免疫性疾病和炎症性疾病。近年来研究 发现，cQ在肿瘤治疗中具有良好的作用，在体外能够抑制肝癌细胞HepG2生长，本文就CQ对鼻咽癌细胞凋亡的影响及其相关作用机制作一探讨。
1 材料与方法
1．1 主要仪器与试剂 酶标仪：Synergy HT公司；流式细胞仪：美国BECTON DICKNSON公司；RPMI一1640培养基、胰蛋白酶：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青公司；二甲基亚矾(DMSO)：Sigma公司。
1．2 细胞培养人鼻咽癌低分化CNE．2Z细胞由中山大学冻存培养。CNE．2Z细胞培养于含5％胎牛血清、青霉素(80 u／m1)、链霉素(100u／m1)的RPMI一1640培养液中，5％CO2、饱和湿度、37 clC培养箱中培养，每2～3 d传代1次。
1．3 MTT法检测细胞存活率将人鼻咽癌低分化CNE一2Z细胞接种于96孔板细胞培养板中，每孔5×10 ～7×10 个细胞。于5％ CO2饱和湿度37 培养箱中培养24 h后，用不同浓度的cQ(2、4、8、16、32umol／L)处理，同时设阴性对照组和空白对照组，并在培养24、48、72 h后加入20mol(以PBS配成5 mg／m1)，37℃继续培养4 h，弃上清液，每孔加入150 Ixl DMSO，37℃孵育30 min，酶标仪上振荡10 min，使结晶充分溶解后以酶标仪检测波长490 nm处吸光度(A)值，计算细胞存活率：细胞存活率=实验组A值／对照组A值×100％ 。实验重复3次。
1．4 集落克隆实验用含体积分数5％ FBS的培养基调整细胞浓度后，分别以每孔1×10 个细胞接种于6孔板中，24 h后加4、8、16、32umol/L CQ处理鼻咽癌细胞，置CO 孵箱中培养7 d，观察到细胞集落形成后，去除培养基，PBS洗涤2遍，75％ 的乙醇一20℃ 固定10 min，结晶紫染色，统计集落形成率。实验重复3次。
1．5 碘化吡啶(propiodide，PI)染色检测细胞凋亡将对数生长期的细胞制成单细胞悬液接种于l2孔细胞培养板，每孔1×10 个细胞，培养24 h后，用不同浓度的CQ(0、4、8、16mol／L)处理，继续培养24 h收集细胞至1O ml离心管，2 500 r／min，离心5 min，去上清液，加入体积分数为75％的乙醇4℃固定过夜。将细胞转移至5 ml离心管1 500 r／min离心5～10 min，去上清液，用PBS洗涤离心2 500 r／min，5 min，去上清液，每管加入600 lPI缓冲液，避光孵育3～4 h，流式细胞仪检测具有亚G．期DNA含量的细胞比例，以统计凋亡细胞率。
以上实验重复3次。
1．6 Western blot检测葡萄糖调节蛋白(glucose—regulated protein 78，GRP一78)的表达 将CNE-2Z细胞制成单细胞悬液接种于6孔细胞培养板，5×10 ／孔，培养24 h后10 Ixmol／L CQ处理细胞，分别于0、6、16、24 h后收集蛋白，检测GRP一78的表达。
采用BCA蛋白定量试剂盒测定所提蛋白浓度。SDS．PAGE电泳，转膜；5％脱脂牛奶封闭室温封闭2 h(或4℃过夜)，一抗室温孵育2 h，洗膜后加二抗，室温孵育2 h；ECL发光试剂盒显影；Bin—Rad凝胶成像系统获取图像。
1．7 统计学方法采用方差分析及q检验。
2 结果
2．1 MTF检测CQ对鼻咽癌细胞CNE-2Z增殖抑制的影响 CNE-2Z细胞经不同浓度CQ处理后，MTI结果显示，24 h时，16、32umol／L CQ组A值均显著低于空白对照组和2、4、8umol／L CQ组(P<0．01)，8umoL／L CQ组A值低于2umol／L CQ组(P <0．05)，且32 Ixmol／L CQ组亦显著低于16umoL／L CQ组(P<0．O1)，对照组及2、4umol／LCQ组间差异均无统计学意义(P>0．05)；48、72 h时，8、16、32 umol／L CQ组A值间差异均有统计学意义(P<0．O1)，且均显著低于空白对照组和2、4 umol／LCQ组(P<0．O1)，48 h和72 h时，4umol／L CQ组A值均低于空白对照组和2moL／LCQ组(P<0．05)，但72h时2、4umoL／L CQ组均显著低于空白对照组(P<0．01)。以16umol／L CQ为例，24、48、72 h细胞存活率分别为85．94％、75．34％ 和56．45％。
2．3 CQ诱导鼻咽癌细胞CNE．2Z凋亡的作用 用不同浓度CQ处理CNE一2Z细胞，进行P1染色，并通过流式细胞仪分析，观察药物诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用(见图1)。结果发现，l6、32 kmol／L CQ组24 h凋亡率均明显高于空白对照组和8 wmol／L CQ组(P<0．01)，而且32mol／L CQ组亦显著高于8mol／L CQ组(P<0．01)。
2．4 cQ对GRP-78表达的影响结果显示，cQ诱导鼻咽癌细胞上调GRP-78的表达。
3 讨论鼻咽癌是一种多基因遗传性肿瘤，在中国南方和国外的中国南方移民及后裔中发病率极高，严重危害了我国南方地区人民生命健康。尽管单纯放疗对早期鼻咽癌有良好的控制，但对晚期鼻咽癌缺乏有效疗效，预后也较差，放、化联合治疗后5年存活率仅50％左右，因此，寻求综合治疗包括新的鼻咽癌化疗药物，是该领域当前研究热点之一。本文以低分化鼻咽癌细胞CNE一2Z作为研究对象，通过体外实验来研究CQ对鼻咽癌细胞生长抑制作用，并初步探讨CQ对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响。MTT法显示，不同浓度的CQ对鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖均有抑制作用，且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，药物对细胞的抑制作用增加；集落克隆实验显示，随着CQ浓度的增高，鼻咽癌细胞克隆数明显减少，CQ在低浓度下对鼻咽癌细胞CNE-2Z增殖有明显的抑制作用；PI染色检测细胞凋亡实验发现，CQ能够很好地抑制鼻咽癌细胞CNE-2Z的增殖，并促进其凋亡，其机制可能通过引起过度的内质网(ER)应激反应有关。
内质网应激反应在细胞凋亡中起关键作用。
为此，本实验采用Westem blot检测10mol／L CQ处理鼻咽癌CNE-2Z细胞0、6、16、24 h内质网应激反应标志物GRP-78的表达。结果显示，CQ呈时间依赖性诱导鼻咽癌细胞上调GRP-78的表达，提示CQ可能通过上调GRP-78的表达，诱导鼻咽癌细胞凋亡。GRP-78是内质网功能的中心调节者，鉴于其在蛋白质折叠、聚集、促进非折叠蛋白降解、ERca连接和控制内质网跨膜感受器的激活等过程中具有重要作用，因而GRP-78的诱导被广泛用作内质网应激和未折叠蛋白反应未折叠蛋白反应(UPR)启动的动的生物标志。此外，肿瘤细胞程序性合成GRP．78维持内环境的稳定，构筑自身防御机制。在生长环境恶劣的肿瘤微环境中，鼻咽癌有效抑制瘤细胞的生长、繁殖。
综上所述，存活蛋白重组腺病毒载体构建能有效刺激机体T淋巴细胞增殖，增强抗瘤相关细胞因子的分泌，能有效抑制瘤细胞的生长和繁殖，在一定程度上有较好且显著地抗瘤疗效，有一定临床推广价值。
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