中华护士杂志在线投稿    消化科杂志投稿  内科杂志投稿  医学杂志投稿
　　复方中组方药材较多,多糖种类也较复杂,标准多糖难以确定,多数方法是选取复方中某单味药材多糖为标准测定换算因子,其含量分析结果缺乏准确性。本试验是在明确抗肺癌A549细胞多糖组分的研究基础上,以它作为标准多糖测定复方有效多糖含量,可为复方多糖含量的测定方法提供参考,其测定结果准确,具有实际意义。
　　1  仪器与试药
　　UV-2401紫外分光光度计；FA1104N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；IR-435红外光谱仪(日本岛津)。蒽酮(分析纯、国药集团化学试剂有限公司),浓硫酸(上海化学试剂有限公司)；DEAE(OH-1)纤维素(上海恒信化学试剂有限公司)；乙醇、正丁醇、三氯甲烷等试剂为分析纯。葡萄糖(中国药品生物制品检定所)；麦冬、沙参、猫爪草、仙鹤草、红花、玉竹等均购自于安徽铜陵中药饮片有限公司。
　　2  方法与结果
　　2.1  样品的制备
　　2.1.1  复方多糖成分的提取
　　全方药材粗粉用水浸泡1 h,然后煮沸1 h,过滤,收集滤液,共提取3次。合并滤液、浓缩,将浓缩后的滤液加乙醇至含醇量达70%,离心,弃去上清液,沉淀用蒸馏水溶解,采用Sevag法除去蛋白,用氯仿-正丁醇(5∶1)萃取多糖水溶液,静置后弃去中间变性蛋白层,反复多次,直到蛋白除尽为止。将上层水液浓缩至干燥,即为复方多糖提取物。
　　2.1.2  多糖组分的精制
　　取部分“2.1.1”项下的多糖提取物溶于蒸馏水,上DEAE纤维素柱(OH-型),收集0.15 mol/L NaCl洗脱液,透析脱盐,浓缩干燥,即得精制多糖组分。
　　2.1.3  单味药材多糖成分的制备
　　分别取麦冬、沙参、玉竹、猫爪草、仙鹤草等按“2.1.1”项下的操作方法制得单味药材多糖提取物。
　　2.1.4  葡萄糖标准品溶液的制备
　　精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.038 5 g,用蒸馏水定容到25 mL,得1.54 mg/mL葡萄糖标准液。
　　2.1.5  多糖组分贮备液的制备
　　取“2.1.2”项下制得的精制多糖组分3 mg,精密称定,用蒸馏水定容至25 mL,作为多糖组分贮备液。
　　2.1.6  复方多糖供试液的制备
　　取“2.1.1”项下制得的复方多糖提取物0.101 36 g,精密称定,置25 mL容量瓶中,稀释至刻度,作为复方多糖供试液。
　　2.2  多糖组分的定性分析
　　2.2.1  紫外扫描分析
　　取多糖组分适量,加0.9%NaCl溶液溶解,配成浓度为5 mg/mL的溶液,在200～400 nm范围内扫描,结果表明,在240 nm和260 nm处无吸收,表明该多糖不含核酸和蛋白质。
　　2.2.2  红外光谱分析
　　分别取精制多糖组分及单味药多糖2 mg,与400 mg干燥的溴化钾混匀,在玛瑙研钵中研磨5～10 min,压片,在红外光谱仪上测定。结果表明,精制多糖组分在3 400/cm和2 930/cm处的宽峰分别为多糖的O-H键和C-H键引起的吸收,在880/cm处的吸收表明此多糖存在β型糖苷键。多糖组分与组方药单味药多糖的红外光谱对比表明,玉竹、猫爪草、仙鹤草多糖与复方多糖组分红外图谱及特征吸收峰有很大的相似性。3个单味药多糖除了在2 930、3 400/cm处的特征吸收外,2 350、1 620、1 420、1 020/cm特征吸收峰均与多糖组分相似,由此初步推断,该复方多糖组分来源于这3味药材。
　　2.3  多糖含量测定方法学考察
　　2.3.1  最大吸收波长的确定
　　分别精密吸取“2.1”项下葡萄糖标准液、多糖组分标准贮备液、复方多糖供试液各1 mL至具塞试管中,以蒸馏水作空白,分别加0.2%蒽酮-硫酸试剂4.0 mL,摇匀后迅速置于冰浴中,冷却后,一起浸入沸水浴中加热7 min,取出后冷却至常温,用UV-2401紫外分光光度计在200～800 nm处扫描[1]。各溶液在599 nm处均有最大吸收峰,由此确定检测波长为599 nm。
　　2.3.2  葡萄糖标准曲线的绘制
　　精密吸取“2.1.4”项下的葡萄糖标准溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL分别置于25 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度线,制成系列标准溶液。按“2.3.1”项下方法在599 nm处测吸光度,以吸光度(Y)对葡萄糖浓度(X)作回归处理,得回归方程：Y＝9.485 9X＋0.003 9(R2 ＝0.998 3),线性范围为0.018 48～0.092 40 mg/mL。
　　2.3.3  转换因子的测定
　　精密吸取“2.1.5”项下的多糖组分贮备液1 mL,按“2.3.1”项下方法测定吸光度,求出多糖液中相当于葡萄糖的浓度(C)。按下式计算换算因子：f＝w/c·d。其中w为多糖重量(mg),d为多糖稀释因素(mL),测得f＝3.35。
　　2.3.4  实验
　　连续精密称取同一份复方多糖样品0.05 g置25 mL容量瓶中,稀释至刻度,精密吸取1 mL,按“2.3.1”项下方法操作,进行测定,结果表明精密度较高,RSD＝4.06%。取“2.1.1”项下制得的复方多糖2.027 mg,分别加入不同量的多糖组分,置于25 mL容量瓶中,稀释至刻度,精密吸取1 mL,按“2.3.1”项下方法进行测定,结果表明,平均回收率为98.07%,RSD＝1.71%。说明该测定方法准确可行。
　　2.4  复方多糖组分的含量测定
　　取“2.1.1”项下制得的复方多糖提取物0.253 4 g(全方原药材量4.759 g),定容至25 mL,取5 mL再定容至25 mL,精密吸取1 mL,按“2.3.1”项下方法测吸光度,按公式：含量(%)＝C×D×f×100/W计算该方中多糖组分含量。其中：C为样品液的葡萄糖浓度(mg/mL),D为样品液的稀释因素(mL), f为转换因子,W为原药材重量(mg)。测得复方中多糖组分的含量为1.41%。