磁性纳米粒子固定酶修饰电极的制作实验分析-医学检验大专毕业论

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　　实验部分
　　2.1 仪器与试剂
　　MPIE型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）； M1703型红外光谱仪（PerkinElmer公司）；三电极系统：工作电极为自制的磁性纳米粒子固定酶修饰电极（GOD/Fe3O4/SPCE/CME），参比电极为Ag/AgCl饱和KCl电极，铂丝为对电极；Bransonic200超声清洗仪；pHS2C型精密酸度计。
　　3氨基丙基三乙氧基硅烷；葡萄糖氧化酶（GOD，120 U/mg，Sigma公司）；标准葡萄糖储备液，放置过夜后使用，保存于4 ℃冰箱中。鲁米诺（＞98%，Fluka公司）；戊二醛（25%，上海化学试剂厂）；其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水（18.2 MΩ·cm）。
　　2.2 酶传感器的制作
　　2.2.1 固体石蜡碳糊电极的制作
　　参考文献[1３]，取3 cm长的铁棒（外径 2.55 mm）和2 cm长的玻璃管（3.0 mm i.d），磨平铁棒和玻璃管的两端，用水洗净。按一定比例混合固体石蜡和碳粉，加热熔化石蜡，均匀搅拌，制得石蜡碳糊。把铁棒插入玻璃管中距底部约0.5 mm，形成一个凹坑，趁热将石蜡碳糊封装进此凹坑，填平，冷却，除去玻璃壁外的沾粘的碳糊，并在光滑打印纸抛光电极表面。然后分别用HNO3（1∶1， V/V）、无水乙醇和二次蒸馏水清洗电极。在1.0 mol/L H2SO4溶液中采用循环伏安（CV）法活化作为工作电极的SPCE，扫描范围1.2～－1.2 V。再于5 mmol/L K3Fe（CN）6溶液中循环扫描，扫描范围改为0.5～－0.2 V。重复上述步骤直至得到峰形良好的一对可逆氧化还原峰。
　　2.2.2 磁性纳米粒子的制备、氨基化和葡萄糖氧化酶修饰
　　按照n（Fe2+）∶n（Fe3+） = 1∶1.75称取适量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，溶于水中。搅拌下快速加入适量 2.0 mol/L NaOH溶液，调pH值至11.0，室温下搅拌0.5 h，迅速升温到75 ℃，熟化0.5 h，整个过程都在氮气的保护下进行，得黑色悬浮液。超声15 min，磁铁分离不溶物，用水洗涤至溶液呈中性。在75 ℃下真空干燥，得粉末，4 ℃下密闭保存在。
　　取20 mL乙醇，加入50 mg Fe3O4纳米粒子粉末，超声分散，之后加入0.2 mL 3氨基丙基三乙氧基硅烷（98%），在氮气的保护下，25 ℃搅拌12 h制得氨基化的磁性纳米粒子，用无水乙醇、水超声清洗后定容至20 mL备用。
　　取2.0 mL上述溶液于5 mL试管中，晾干，再于试管中加入2.0 mL 0.25%戊二醛，混旋30 s后，放入4 ℃冰箱冷藏1 h，之后水洗并晾干，再加20 g/L GOD溶液2.0 mL，于4 ℃冰箱中保存12 h，制得GOD修饰的磁性粒子溶液（GOD/ Fe3O4）。图1为磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶的示意图。SPCE电极面朝上，用磁铁吸住电极上端铁芯，滴加15 μL GOD/Fe3O4粒子在电极表面，制得酶修饰电极（GOD/Fe3O4/SPCE/CME）。测定时将电极面对准光电倍增管检测方向。每次更新电极时，移去磁铁，水洗去磁性复合粒子，之后重复上述过程以更新电极。
　　在酶传感器中采用纳米材料为载体，不仅可以增加酶的固定量和稳定性，而且还可以提高酶的催化活性，进而提高酶电极的响应灵敏度[９]。Fe3O4磁性纳米粒子具有纳米粒子的诸多优点，又具有非常好的生物相容性，在外加磁力的作用下能非常方便地实现电极敏感膜的更新，故在酶传感器研究中得到了广泛应用[１０～1７]。但是在ECL葡萄糖传感器中，使用Fe3O4磁性纳米粒子固定GOD还未见报道。本研究通过交联剂将GOD共价固定在Fe3O4磁性纳米粒子表面，再通过磁力将此固载酶的磁性纳米粒子修饰在SPCE表面，从而制成了易更新的酶传感器，并用于葡萄糖的ECL分析。