【摘要】 目的 探讨补阳还五汤对体外培养的星形胶质细胞反应性增生的抑制作用。方法 分离培养新生Wistar大鼠脊髓的星形胶质细胞,将细胞培养皿随机分为补阳还五汤组和不加中药的空白对照组。用塑料吸头划刮培养皿,制造机械损伤的模型,继续培养至72 h,分别取出不同时间点的细胞进行胶质细胞增生情况的观察和免疫组织化学染色,对胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达产物光密度进行图像分析。结果 在划痕后2～48 h,补阳还五汤组星形胶质细胞增生比较轻微,GFAP表达与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 补阳还五汤可以抑制神经胶质细胞反应性增生,有利于改善损伤脊髓修复再生的微环境。
脊髓损伤后,星形胶质细胞反应性增生,最终形成胶质瘢痕,并且高水平表达胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),这已经是一个多世纪以来公认的学说。我们以前的光镜观察表明,补阳还五汤对于脊髓损伤诱发的星形胶质细胞反应性增生具有一定抑制作用[1]。为了进一步研究补阳还五汤对星形胶质细胞反应性增生的调制作用,我们用星形细胞培养-划痕实验进行了观察。
1 材料与方法
1.1 脊髓星形胶质细胞培养
选择当日出生的Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供,合格证号：00519925),无菌条件下取脊髓,剔除软脊膜及血管后,剪成1 mm3的小块,放置在培养液内。用0.25%胰蛋白酶37 ℃消化1 h；用DMEM培养液(含20%胎牛血清,2 mmol/L谷氨酰胺,0.6%葡萄糖)终止胰蛋白酶的消化作用；用吸管吹打,使消化后的脊髓组织分散成单个细胞的悬液。把细胞悬液接种于涂有多聚赖氨酸的35 mm2培养皿中,种植密度为1×105个/cm2；于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；24 h后换成10%胎牛血清的DMEM培养液培养,每3 d换液1次；培养至第12日,加入10 mmol/L 左旋酪氨酸甲基脂于37 ℃放置1 h,除杀小胶质细胞；立即更换新培养液,在CO2培养箱中维持培养至第15日,星形胶质细胞长满培养皿底。
1.2 划痕损伤实验
1.2.1 分组
于第15日时,将细胞培养皿随机分为补阳还五汤组和不加中药的空白对照组(每组7个培养皿,即分为7个时间点)。
1.2.2 划痕
用塑料吸头划刮培养皿,造成宽约1 mm、长约1.5 cm的损伤带。
1.2.3 再培养
划痕后立即编号和更换培养液。补阳还五汤组的培养液中按5 ηL/mL比例加入补阳还五汤,空白对照组只更换培养液。放入37 ℃、CO2培养箱中继续培养。
1.2.4 显微镜观察和记录
在划痕后0、2、6、12、24、48、72 h等7个时间点分别取出培养皿,对划痕区星形细胞生长情况进行显微镜观察、拍照和记录。
1.3 胶质原纤维酸性蛋白表达实验
1.3.1 固定
样本用PBS(pH 7.3)冲洗后,立即用4%多聚甲醛在室温下固定1 h。再用PBS清洗3次后,放入4 ℃冰箱内保存。
1.3.2 胶质原纤维酸性蛋白表达反应
至所有时间点样本收齐后,按ABC法进行GFAP表达的免疫细胞化学反应。
1.3.3 胶质原纤维酸性蛋白表达产物光密度的图像分析
从每一个时间点的样本中随机选择划痕边缘的5个视野,用CIMAS软件对视野内的神经胶质细胞面积和细胞质内GFAP阳性反应物的积分光密度进行测定,对数据进行单因素方差分析。
