探讨VEGF在肿瘤DC免疫抑制机制中的作用河南论文发表网

河南论文发表网   河南自考毕业论文   河南商专论文格式   国家级论文发表
    在机体正常和异常免疫系统中，树突细胞（DC）是功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)，是触发免疫应答的核心因素，在正常肿瘤免疫中发挥重要的作用[1,2]。有报道肿瘤细胞分泌的可溶性因子能够抑制DC的产生、分化和成熟，对肿瘤宿主DC的数量和功能缺陷起着重要的调控作用，从而抑制机体对肿瘤细胞的免疫杀伤作用[3～5]。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤细胞分泌的可溶性因子的一种，在肿瘤血管的生成中起着关键作用，其是否在机体的肿瘤免疫抑制中也起着关键的作用呢？本研究依据iRNA原理[8]，以MCF7乳癌细胞株作为研究对象，在mRNA水平上关闭VEGF基因的表达，观察VEGF基因沉默前后肿瘤细胞分泌的上清液对DC功能的影响，以进一步探讨VEGF在肿瘤DC免疫抑制机制中的作用，为乳癌的临床治疗寻找新的靶点。
    1       材料与方法
    1.1       材料
    1.1.1       试剂及引物       Lipofectamine 2000TM及TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；AMV 逆转录试剂盒、兔抗VEGF多克隆抗体（sc507）、ECL发光试剂分别为美国Promega公司、Santa Cruz公司和北京普利莱公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司产品；人白细胞介素12（IL12）和干扰素γ（IFNγ）的ELISA检测试剂盒均购自深圳晶美生物工程有限公司；粒细胞巨细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素4（IL4）及肿瘤坏死因子α(TNFα)购自Peprotech公司。Hoechst33258由碧云天生物试剂公司提供；所有引物均由上海生工公司合成。
    1.1.2       细胞株       乳癌MCF7细胞株购自中国协和基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数0.10的胎牛血清的RPMI 1640（PAA公司产品）培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05的CO2饱和湿度的孵箱中培养传代。
    1.2       小干扰RNA（siRNA）的设计合成
    在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人VEGF mRNA的全长序列(其序列号为:AB021221)，结合设计软件和文献[9,10]报道，确定VEGF siRNA和阴性对照siRNA SCR（scramblesiRNA）序列分别为：5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCUU3′(正义链)，5′GAUCUCAUCAGGGUACUCCUU3′(反义链)；5′GCGUAACGCGGGAAUUUACUU3′(正义链)，5′GUAAAUUCCCGCGUUACGCUU3′(反义链)。上述两段siRNA序列均行BLAST比对检查以保证和其他基因没有同源性，并且对VEGF siRNA序列末端均进行甲基化修饰（黑斜体所示修饰位点），由上海吉凯生物技术有限公司化学合成。
    1.3       转染
    根据Lipofectamine 2000TM试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA 进行转染条件的优化。取对数生长期的MCF7细胞,调整细胞的密度，接种于12孔培养板，采用含体积分数0.10的血清（不含抗生素）的PRMZ 1640培养液培养，次日细胞贴壁后弃去旧培养液待转染。设立空白对照组、脂质体组、不同浓度（50、100、200 nmol/L）的siRNA组和siRNA SCR 转染组，siRNA与Lipofectamine 2000TM分别用适量不含血清和抗生素的RPMZ 1640稀释，5 min内将其混合，室温下静置20 min后加入细胞孔中，细胞置于培养箱常规培养，6 h后荧光显微镜下观察。选择siRNA与Lipofectamine 2000TM最佳转染比例。
    1.4       半定量 RTPCR 检测VEGF mRNA的水平
    收集转染24 h细胞，按照Trizol试剂盒操作说明提取细胞总RNA, 所提RNA溶于50 μL无酶水中，Eppendorf核酸定量测定仪测定RNA浓度和纯度，并在8 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，观察RNA完整性。将1 g总RNA在20 μL体系中行逆转录反应，取cDNA后续25 μL体系行PCR反应，并以无酶水作为阴性模板对照。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min, 94 ℃变性90 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s；33个循环后,72 ℃延伸7 min。VEGF上游引物序列:5′CCTTGCTGCTCTACCTCC3′，下游引物:5′AAATGCTTTCTCCGCTCT3′，扩增产物长序列为421 bp；内参照GAPDH上游引物序列：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′,扩增产物长为226 bp。PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，观察并拍照,并应用天能分析软件对条带进行吸光度（A）扫描，检测各组VEGF mRNA扩增产物与其对应的内参GAPDH mRNA扩增产物吸光度值，然后将AVEGF/AGAPDH的比值进行统计学分析。
    1.5       Western blotting检测VEGF蛋白的表达
    常规消化收集已转染48 h的细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗2次，弃上清，加入细胞裂解液[1 g/L十二烷基磺酸钠(SDS), 100 mg/L苯甲基磺酰氟（PMSF），体积分数0.01的NP40，5 g/L去氧胆酸钠,0.2 g/L 叠氮钠,1 mg/L抑蛋白酶肽（Aprotinin），150 mmol/L的NaCl以及50 mmol/L TrisHCl，pH 7.5] 冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心5 min,收集上清液定量，取100 μg蛋白上样，在120 g/L的SDSPAGE上电泳, 蛋白充分分离后，转移到PVDF膜(Sigma 公司)上，于含50 g/L脱脂奶粉的封闭液中4 ℃过夜。VEGF一抗1∶300 稀释，室温孵育2 h, 二抗1∶2 000稀释，室温孵育1 h，ECL发光试剂对PVDF膜进行显色反应，X线下曝光、拍照。对条带行吸光度扫描，检测各组VEGF蛋白和内参βactin蛋白所对应条带吸光度值，将AVEGF/Aβactin比值进行统计学分析。
    1.6       MCF7乳癌细胞培养上清液的制备和收集
    传代培养MCF7乳癌细胞，用含体积分数0.10的胎牛血清的RPMI 1640培养液将细胞的密度调整为1×109/L，置于6孔板中，在37 ℃、饱和湿度、体积分数0.05的CO2环境下培养48 h，600 r/min 离心5 min，收集培养上清液，标记为sVEGF(对照)；同样条件培养另一6孔板将细胞的密度调整为2×109/L，以100 nmol/L siRNA转染24 h后，培养液漂洗2次，去悬浮凋亡细胞后，换液，培养48 h收集培养上清液，标记为siRNAVEGF。
    1.7       DC的体外培养
    取正常人外周血，用PBS将抗凝血稀释1倍混匀，将淋巴细胞分层液(Ficoll)与稀释血液按体积比例1∶1混匀后，以2 000 r/min 离心25 min。用毛细吸管轻插至白膜层，沿管壁周缘吸出界面层细胞，移入另一无菌刻度离心管中，用5倍体积的PBS洗涤、离心，以1 500 r/min离心10 min，去上清液。重复洗涤3次，无血清RPMI 1640重悬细胞，调整细胞悬液密度为1×109/L。接种于24孔培养板，每孔1 mL。在37 ℃、饱和湿度、体积分数0.05的CO2环境下贴壁2 h，吸去未贴壁细胞，以无血清RPMI 1640轻轻振荡洗涤1次(未贴壁细胞收集至另一培养瓶用于T细胞培养)，再次贴壁2 h后，吸去上清，贴壁细胞以体积分数0.10的FCS RPMI 1640培养，分别以半量添加sVEGF为对照组，以半量添加siRNAVEGF为实验组，两组同时加入细胞因子GMCSF（100 μg/L）、IL4（10 μg/L），隔日半量换液，诱导至第6天加100 μg /L的TNFα刺激DC成熟，观察细胞变化,第8天后收获DC。
    1.8       Hoechst33258 染色检测MCF7细胞凋亡
    取对数生长期的MCF7细胞爬片过夜使其贴壁，转染VEGF siRNA 72 h后，吸净培养液,固定液(体积分数0.75的甲醇+体积分数0.25的冰醋酸)4 ℃固定10 min, PBS漂洗2次,加入5 mg/L Hoechst33258，37 ℃避光染色10 min，再次PBS漂洗后封片,荧光显微镜下观察。
    1.9       负载肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的制备
    将DC体外培养的悬浮细胞置于37 ℃、饱和湿度、含体积分数0.05的CO2恒温培养箱内培养过夜，收集细胞于离心管中，以RPMI 1640洗涤，收集离心沉降细胞即为T前体细胞。用含有0.005 g/L的刀豆素A和2×105U/L IL2的RPMI 1640培养基重新悬浮，收集不黏附细胞，每2 d用含有2×105U/L IL2的RPMI 1640培养液换液，培养8 d以后获得T淋巴细胞。取1×106个对数生长期的MCF7细胞于液氮和37 ℃反复冻溶3次,制备肿瘤抗原（TAA）粗提物,实验组加入培养至第6天的DC，继续培养负载抗原48 h。将TAA致敏的DC与T淋巴细胞以1∶20的比例混合共培养2 d，收获悬浮T淋巴细胞，作为CTL。
    1.10       MTT法检测树突细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应
    选用96孔培养板，每孔总液量200 μL，按效靶比（E/T）10∶1、25∶1及50∶1分别加入CTL和MCF7细胞。每个实验孔设2个复孔，每个效靶比分2组进行杀伤实验，每组设立3个复孔，于37 ℃、饱和湿度、体积分数0.05的CO2条件下将MCF7细胞培养18 h后，加入CTL。培养48 h，加5 g/L MTT每孔20 μL,孵育4 h,弃上清,每孔加DMSO 150 μL,振荡10 min,使结晶充分溶解,在酶联仪上570 nm 波长处测各孔吸光度（A）值,按下列公式计算杀伤效应。CTL杀伤效应=(实验组A值-靶细胞自然释放A值-效应细胞自然释放A值)/ (最大释放A值-靶细胞自然释放A值)×100%。
    1.11       ELISA法检测IL12与IFNγ水平
    利用ELISA法检测DC自分泌IL12水平，检测步骤按照说明书进行。将各组DC与正常外周血单个核细胞(PBMC)以10∶1比例混合培养,72 h后收集培养清液,检测DC协同分泌IFNγ水平。
    1.12       统计学处理
    应用SPSS 12.0及PPMS 1.5[7]统计学软件进行数据处理，样本间的均数比较采用t检验。
    2       结果
    2.1       VEGF mRNA表达的变化
    RTPCR检测结果显示，50 nmol/L的siRNAVEGF组、脂质体组、错义序列组VEGF mRNA表达与对照组相比较均无明显差异；100、 200 nmol/L的siRNAVEGF组VEGF mRNA表达与对照组比较有明显差异；而100、200 nmol/L的siRNAVEGF组间比较无明显差异。
    2.2       VEGF siRNA对MCF7细胞VEGF蛋白表达的影响
    Western blotting法检测结果显示，100 nmol/L的VEGF siRNA 转染后，细胞VEGF基因表达与正常对照组比较显著下调（图2）。而脂质体组和错义序列组与正常对照组比较，VEGF基因表达则无明显变化。
    2.3       MTT法检测树突细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应
    效靶比为50∶1时，CTL细胞的肿瘤杀伤效应最高，其中siRNAVEGF组的杀伤率为（66.3±6.8）%，sVEGF组为（17.3±1.8）%，两组比较差异有显著性（t=12.06，P<0.01）。
    2.4       Hochest33258荧光染色观察CTL的肿瘤杀伤效应
    在荧光显微镜下,经紫外线激发,正常对照组核染色质聚集、核碎裂、胞质浓缩。而实验组细胞核呈均匀的蓝色荧光。
    2.5       IL12和IFNγ的分泌水平
    siRNAVEGF组细胞培养上清液中IL12浓度为(393.2±72.5)ng/L,较sVEGF组(106.4±54.7)ng/L明显增高(t=7.74,P<0.01),但两组细胞都未发现IFNγ的自分泌。DC与正常人PBMC诱导的T细胞共培养72 h后，siRNAVEGF组上清液IFNγ含量为（126.4±41.9）ng/L，较sVEGF组的（43.3±12.5）ng/L明显增高（t′=4.66,P<0.05）。
    3       讨论
    肿瘤发生的体内条件首先是机体抗肿瘤免疫功能受损。DC是体内功能最强的专职APC，能摄取、加工和呈递抗原[6]，是惟一能直接激活初始T细胞的APC，负责递呈肿瘤细胞抗原给T、B细胞而诱导抗肿瘤的体液免疫和细胞免疫应答，是抗肿瘤免疫的中心环节。发挥强大的免疫监视功能，特别是在肿瘤特异性T细胞免疫应答过程中起着非常重要的作用，在机体抗肿瘤免疫中发挥主导作用[8]。因此，DC数量减少或功能缺陷可直接导致机体抗肿瘤免疫功能低下[9,10]。肿瘤发生的另一体内条件是肿瘤的自分泌和旁分泌的交互作用，有报道肿瘤细胞分泌的细胞因子在肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用，其机制可能为荷瘤宿主体内的DC因肿瘤源性的细胞因子负调控受损所致。
    VEGF是正常和异常血管生成的重要因子，在各种实体瘤中均有很强的表达[11]，对实体瘤的发生与发展起着关键作用[12]。 VEGF作为肿瘤细胞能够分泌的众多因子中最为重要的一种，可促进实体瘤血管生成，那么它是否在肿瘤免疫负调控中也起着关键的作用呢？
    本实验应用MCF7乳癌细胞分泌的上清液培养正常人PBMC，诱导DC分化、成熟。同时依据iRNA原理，选取课题组已报道的最佳干扰浓度[13]，沉默MCF7乳癌细胞的VEGF基因，然后应用沉默VEGF基因后的MCF7乳癌细胞分泌的上清液培养正常人PBMC，观察所诱导的DC功能的改变。Western blotting检测结果显示，选用的化学合成法获得特异性靶向siRNA能够有效地沉默MCF7细胞的VEGF基因，VEGF基因沉默前后MCF7乳癌细胞分泌的上清液共培养的DC功能差别具有显著性。VEGF基因沉默前MCF7培养的上清诱生的DC不能有效地刺激、诱导正常T细胞的杀伤功能，而VEGF基因沉默后，由DC提呈抗原，诱导的CTL功能较沉默前明显增强。培养上清液中IL12浓度和协同刺激PMNC分泌IFNγ的含量也明显提高。
    DC参与抗肿瘤的主要机制是保证DC对肿瘤抗原的摄取,摄取抗原后DC发育成熟，膜表面高表达MHCⅠ、Ⅱ类分子、共刺激分子等黏附分子。通过肽MHC类分子TCR、B7CD28等分子间的稳固连接，向T细胞内传递信号，促进T细胞的激活。二者缺乏时单一激发T细胞受体不能有效地刺激T细胞的增殖，甚至导致T细胞无能[14,15]。DC与T细胞结合后可分泌大量的IL12，诱导T细胞、自然杀伤细胞、淋巴因子激活杀伤细胞产生大量TNFγ、穿孔素和颗粒酶,增强对靶细胞的溶解作用[16]。实验结果说明，MCF7细胞分泌的VEGF抑制了DC的正常发育成熟，导致向T细胞内传递信号的分子间稳固连接不能形成，从而不能有效地刺激T细胞的增殖，对靶细胞不能发挥有效的杀伤作用。这可能是高表达VEGF实体瘤荷瘤宿主机体抗肿瘤免疫功能受损的机制之一。

探讨VEGF在肿瘤DC免疫抑制机制中的作用 河南论文发表网

探讨VEGF在肿瘤DC免疫抑制机制中的作用河南论文发表网