半胱氨酸蛋白酶（Calpains）是广泛存在于哺乳类动物细胞浆内的半胱氨酸蛋白酶家族，依赖细胞浆内的钙离子浓度增加而激活。激活后的Calpains可以降解细胞骨架蛋白、电压及配体门控性离子通道及与信号转导有关的G蛋白及酶等［1，2］。应用形 态学及生化等指标的研究显示，Calpains抑制剂可以显著减轻神经元缺血低氧性损伤［3］。然而，该酶抑制剂能否促进缺血低氧后神经元功能的恢复还缺乏直接的证据。本实验采用大鼠离体海马脑片，运用细胞内记录技术，结合碘化丙啶（PI）染色法，计数海马CA1区死亡神经元，以期对Calpains抑制剂PD150606对神经元低氧性损伤的影响进行客观及全面的评价。
1 材料与方法
1.1 材料 选择SD大鼠12只，雄性，体质量280～340 g，由美国纽约州立大学医学中心提供。人工脑脊液（aCSF），含有NaCl 126 mmol/L，KCl 3 mmol/L，KH2 PO41.4 mmol/L， NaHCO326 mmol/L， MgSO41.3 mmol/L，CaCl21.4 mmol/L，葡萄糖 4 mmol/L 。Calpains抑制剂PD150606，来源于美国Calbiochem公司;PI由Molecular Probes公司提供;二甲亚砜（DMSO）来源于Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1海马脑片的制备 将SD大鼠置于麻醉箱内，麻醉前预先吸纯氧3 min，然后用体积分数0.02异氟烷（Isoflurane）麻醉，待大鼠翻正反射消失后断头，快速取脑并将脑组织放入冰冷（4 ℃）预充氧的aCSF中，沿冠状切片制备厚度为400 μm的海马脑片，放置于尼龙网上，在以体积分数0.95 O2 +体积分数0.05 CO2 混合气体饱和的aCSF中室温下孵育2.0 h后用于实验。
1.2.2海马脑片的分组 将海马脑片随机分为单纯低氧对照组（Con组， n =6）、PD50组（ n =10）以及DMSO组（ n =8）。Con组海马脑片在细胞内膜电位稳定15 min后应用正常的脑脊液灌流60 min;PD50组、DMSO组的海马脑片在神经元膜电位稳定15 min后，分别用含50 μmol/L PD150606及体积分数0.003 DMSO的aCSF灌流60 min。所有海马脑片均应用体积分数0.95的N2 和体积分数 0.05 CO 2 混合气体饱和的aCSF低氧灌流5 min，复氧60 min。应用细胞内记录技术，分别记录用药前及低氧前膜电位、缓慢除极的速率、快速除极时间、快速除极幅度，以及复氧60 min时海马CA1区神经元对细胞内注入电流及对SCHAFFER侧支刺激的反应，将对刺激可以产生幅度高、持续时间短的动作电位作为神经元功能恢复的标志。
1.2.3死亡神经元的测定［4］ 应用PI染色法进行海马CA1区死亡神经元计数。电生理实验结束后，将上述各组的海马脑片放入含有5 mg/L PI的aCSF中充氧孵育染色15 min，染色过程中注意将染色试剂避光，随后用氧饱和的aCSF洗涤海马脑片2次。应用Noran激光共聚焦显微镜，选择Rho-damine滤色镜（488 nm/515 nm）进行观察，首先在低倍显微镜下（4倍）确定海马CA1区的位置，然后 在高倍显微镜下（40倍）计数海马CA1区中任意4个视野中PI染色的神经元数，计算其平均值。
1.2.4统计学处理 所有数据以均数±标准差表示，以SPSS 11.0程序包统计软件进行统计学处理，多组数据之间的比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1PD150606对海马CA1区神经元电生理特性的影响 3组神经元用药前的基础膜电位及低氧前的膜电位值之间差异均无显著性（ F=0.494，P > 0.05 ）。
2.2PD150606对低氧期间神经元膜电位的影响 PD50组神经元的快速除极时间大于DMSO组和Con组，但差异无显著性（ F=1.476，P >0.05）。PD50组、DMSO组及Con组间神经元的缓慢除极速率比较无明显差异（ F=1.789，P >0.05）。PD50组神经元快速除极幅度显著低于DMSO组及Con组，差异有显著意义（ F=13.711，q=6.199、 6.229 ， P < 0.05），而DMSO组与Con组之间则无明显差异（ P >0.05）。PD50组10例经过PD150606孵育的神经元中，8例在复氧后膜电位逐渐恢复到基础值水平，细胞注入电流后产生高幅度、持续时间短的动作电位;经SCHAFFER通路刺激可以产生兴奋性突触后电位。
3 讨论
脑缺血低氧性损伤是临床上常见的一种病理生理现象。一般认为其损伤机制主要与能量代谢障碍、大量兴奋性氨基酸的释放及钙离子超载等有关。但临床研究显示，基于上述机制的许多药物及方法对缺血低氧性神经元并无明显的保护及治疗效果。因此，有学者认为，钙离子超载所介导的酶促水解反应在脑缺血低氧性损伤中可能发挥更大的作用［1］。Calpains是哺乳类动物细胞中广泛存在的一种半胱氨酸蛋白酶，有μ和m两种亚型，两种亚型的Calpains均含有钙调素样的Ca2+结合区域，但对Ca2+的敏感性不同。体外实验表明，μ-Calpain在微摩尔浓度的钙离子水平即可被激活，而m-Calpain则需要毫摩尔浓度的钙离子水平方可激活。Cal-pains确切的生理功能还不清楚，可能在由钙离子介导的细胞内信号传导过程中发挥着重要的作用［5］。但近来的研究显示，即使短暂的缺血低氧也可以显著增加Calpains的活性［6］。在正常情况下，体内存在一种Calpains的内源性抑制剂Calpastatin。低氧时激活的Caspase-1和Caspase-3可以引起Calpastatin的分解，从而消除或减弱了Calpastatin对Calpains的抑制，使Cal-pains的活性进一步增强。激活的Calpains可降解细胞的骨架蛋白成分，如微管相关蛋白（MAP）等;同时，激活后的Calpians还可以降解与细胞周期及细胞转录有关的蛋白成分，导致细胞死亡［1］。此外，激活的Caplains可以破坏神经元中溶酶体膜的完整性，导致溶酶体酶外漏，从而引起细胞死亡。PD150606是一种能够透过细胞膜的Calpains抑制剂，可以选择性地抑制Calpains的活性，对Calpains的两种亚型均有抑制作用。本研究显示， DMSO对低氧期间神经元膜电位快速除极的幅度、缓慢除极的速率及快速除极的时间均无明显的影响;但PD150606可以显著延缓神经元快速除极时间，降低快速除极的幅度，促进复氧后神经元功能的恢复。PD50组的10例神经元中，有8例神经元复氧60 min后恢复对细胞内注入电流及经SCHAF-FER旁路刺激的反应。正常情况下，PI不能透过细胞膜完整的神经元，但由于缺血低氧可以使神经元细胞膜的完整性破坏，使PI可以穿过细胞膜进入细胞核，与核内的DNA结合，发出高强度的红色荧光。
