近年来的研究表明，脑缺血一再灌注后继发性脑损伤机制主要包括炎性反应增强、兴奋性氨基酸中毒、钙超载、氧化应激、细胞凋亡程序启动与进展、蛋白溶解酶和氧自由基等分子介质直接损伤神经及血管内皮细胞，引起继发性脑水肿和脑出血，进一步加重脑损伤程度。亚低温保护技术在各种解决方案中具有自己的特色和优势，亚低温作为一种非药物性脑保护方法，与药物治疗比较具有一定的优越性，它可以干预脑缺血．再灌注的多个病理环节，对脑缺血及再灌注损伤起到保护作用，可抑制脑缺血．再灌注后凋亡的发生。
本研究通过观察亚低温对脑缺血及缺血一再灌注后不同时间段Bc1．2、Bax蛋白表达的影响，来探讨亚低温的最佳治疗时间窗。
材料与方法一、试验动物与分组成年健康清洁级雄性Wistar大鼠36只，体重250— 280g，由河北医科大学试验动物中心提供(合格证编号604186)。随机分为2组，对照组(C，6只)与亚低温组(M，30只)。其中亚低温组根据全脑缺血后给予亚低温的时间点不同又分为5组，即缺血后即刻给予亚低温组(M1)、缺血一再灌注后0h组(M2)、6h组(M3)、12h组(M4)、24h组(M5)，每组均为6只大鼠。
二、研究方法
1．模型的制备亚低温组和对照组采用大鼠四条血管阻断全脑缺血模型(Pulsinelli-4VO法)制备大鼠全脑缺血．再灌注模型，缺血时间为15min。对照组置于室温下，保持大鼠肛温在37 4-0．5℃。亚低温组于缺血及再灌注后的不同时间点给予降温，采用冰袋法，冰量按比例100g／100mg体重计算，维持大鼠肛温在31-41°C，每10min测量一次，维持6h后，用白炽灯泡缓慢复温至37 4-0．5°C，术后呼吸不平稳、体温不能维持的大鼠弃之。
2．标本的制备于再灌注后48h麻醉动物(10％水合氯醛腹腔注射，350mg／kg)，分离海马组织置于70％酒精中4"C保存待检。
3．流式细胞分析仪检测 鼠抗人Bax单克隆抗体及抗人Bc1．2单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics．XL II型流式细胞仪，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟和分析。
三、数据处理
1．Bc1．2、Bax蛋白表达定量分析 平均荧光强度(均道值)=Lg(测量值)×3402．统计学分析 数据均以面4-s表示。采用SPSS14．0统计软件单因素方差分析比较组间差别，两两比较时首先检验方差齐性。方差齐时运用LSD—t检验，方差不齐时用Dunnetts~C法进行统计学分析。以P<0．05为差异有统计学意义。1．Bc1．2蛋白表达(均道值) 对照组(c组)与M1、M2、M3组比较，差异有统计学意义(P<0．01)；与M4组比较差异有统计学意义(P<0．05)；与M5组比较差异无统计学意义(P>0．05)。在治疗组中以M2组表达值最高，与其他各治疗组比较，差异有统计学意义(P<0．01)。
2．Bax蛋白表达(均道值) c组与各治疗组比较差异有统计学意义(P<0．01)。在治疗组中以M2组表达值最低，与其他各治疗组比较，差异有统计学意义(P<0．01)。
3．Bcl-2／Bax比值c组与各治疗组比较差异有统计学意义(P<0．01)。在治疗组中以M2组表达值最高，与其他各治疗组比较，差异有统计学意义(p<0．01)。
讨论大鼠全脑缺血．再灌注后神经细胞损伤的主要机制可能与Bcl-2／Bax比例失衡有关 。脑温的轻度降低(30—35％)即亚低温。在脑缺血发作后，一定时间内可以通过治疗而减轻脑损伤的程度，促进机能恢复，提高远期效果，这个特定的时间称为治疗时间窗(therapeutic time window)。脑缺血-再灌注损伤给予亚低温干预，从而改善神经细胞功能的最长允许时间即亚低温治疗时间窗。目前亚低温的治疗时间窗国内外说法不一。Markarian等 用大鼠前脑缺血模型进行亚低温治疗研究时，分别在缺血后0min、15min、30min、45min给予亚低温治疗3h，认为局灶可逆性脑缺血中，亚低温治疗开始的时间必须在缺血发生后30min内。王德生等 采用局部病灶侧亚低温治疗大鼠脑缺血，对缺血后10min、40min、l h持续亚低温治疗2h，发现脑缺血后10min、40min治疗组梗死体积明显小于对照组(P<0．01)，但缺血1h组则与常温脑缺血无明显差异，说明低温的脑保护作用发生在一定的时间窗内。Kurasako等 研究中发现，亚低温治疗时间窗必须在脑缺血后30 min内才能发挥脑保护作用。
童秋玲等 报道脑缺血后即刻实施亚低温干预，可能通过延缓损伤进程，再灌注时使较晚累及的皮质得到拯救。
Bcl-2、Bax是一对细胞凋亡调控基因。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，过量表达可延长神经元存活时间。Bax可诱导细胞凋亡，高表达可加速细胞的凋亡。
Bcl-2和Bax可形成一个凋亡调控系统，当Bax同源二聚体形成，便诱导凋亡；随Bcl-2蛋白表达量上升，越来越多的Bax二聚体分开，与Bc1．2形成比Bax．Bax更稳定的Bax—Bcl一2异源二聚体，从而“中和”了Bax-Bax诱导凋亡的作用，细胞内Bc1．2与Bax的比例调节了凋亡的发生。本实验结果提示，亚低温在治疗时间窗内合适的持续时间可使Bcl-2表达增加，Bax表达降低，Bcl-2／Bax升高，以再灌注后0hBcl一2、Bax的表达最为明显，其抑制细胞凋亡的效果最佳，随再灌注时间延长，效果下降。从Bcl一2／Bax比值看，再灌注24h组仍较对照组有一定疗效，而缺血后即刻亚低温与再灌注6h疗效接近。考虑可能与过早亚低温引起脑缺血一再灌注后低灌流的缓解受到影响有关。故亚低温可有效干预全脑缺血一再灌注损伤后神经细胞的凋亡，且最佳治疗时间窗为缺血．再灌注后0h，但再灌注24h也有一定疗效，故不应过早放弃对缺血性脑损伤的亚低温治疗。
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