我国侵袭性牙周炎(aggressive peri—odontitis，AgP)患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P．gingivalis)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola， denticola)的检出率较高。牙龈卟啉单胞菌代谢产物中含有高浓度的丁酸、乙酸、异戊酸以及中等浓度的丙酸和异丁酸，齿垢密螺旋体代谢产生琥珀酸，当齿垢密螺旋体和牙龈卟啉单胞菌共同培养时，两种细菌生长均加速，但琥珀酸的量减少，提示琥珀酸有可能促进牙龈卟啉单胞菌的生长，在两者间发挥协同作用。龈下微生态是一个复杂的环境，微生物间存在着复杂的竞争、拮抗和共生关系，本研究将对体内条件下，有机酸(琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸)与牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的关系，有机酸的检测能否预测牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的存在和量等问题进行初步探讨。

　　1 资料与方法

　　1．1 研究对象研究纳入北京大学口腔医院牙周科就诊的20例AgP患者，诊断标准参照1999年美国牙周学会颁布的牙周病国际新分类，其中男8人，女12人，年龄16一一34岁，平均年龄(24．5±4．4)岁；14例牙周健康对照者来自北京大学口腔医院的学生和职工，其中男6人，女8人，年龄22—33岁，平均(25．4±3．4)岁。两组纳入的共同条件是：全身无系统性疾病，妇女非妊娠期、未服用避孕药，不吸烟，就诊前6个月内未做过牙周治疗，近3个月未服用过抗生素，无明显的咬合关系异常，无正畸治疗史。AgP患者口内余留牙多于20颗，其中至少有6颗患牙探诊深度(probing depth，PD)≥5 mm，邻面附着丧失(at—tachment loss，AL)I>3 mm，全口根尖片证明有邻面牙槽骨吸收。牙周健康者PD≤3 mm，出血指数(bleeding index，BI，Mazza，1981)≤2，无AL。本研究获北京大学生物医学伦理委员会批准(批准号IRB00001052-08010)，所有受试者均签署知情同意书。

　　1．2 龈沟液的采集和临床检查每位研究对象每象限选一颗牙齿的颊侧近中位点采集龈沟液，取样位点无龋齿、不良修复体和食物嵌塞。患者漱口后隔湿取样位点，记录菌斑指数(plaque index，PLI，Silness and L6e，1963)，并用尖探针刮除龈上菌斑，小棉球擦干牙面，将称重后(精确到0．000 O1 g)的滤纸条(10 mm×2 mm，Whatman，英国)轻插入牙周袋内至遇轻微阻力为止，30S后取出称重，密封于Ep管，一70℃低温冻存，并记录取样位点PD、B1和AL。所有检查均由同一名有经验的医师完成，在实验前非同日对10名慢性牙周炎患者进行PD、AL的自身重复性检验，PD和AL的组内相关系数值为0．99。

　　1．3 龈沟液的处理和检测将滤纸条于检测前解冻，于套管内加入99倍龈沟液量的去离子水，室温下(20℃)舒适型恒温混匀器600 r／min震荡40 min，套管法高速低温离心机(13 000 r／min，直径5．5 cm，4℃)离心15 min，吸取上清液，用高效毛细管电泳仪(Beckman P／ACEsystem 5000，美国)检测样本中琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸的浓度。

　　滤纸条沉淀物用200 TE缓冲液(10 mmol／Ltris—HCL，pH 7．6，1 mmol EDTA)充分荡洗后，离心留取沉淀，用小量细菌基因组DNA快速抽提纯化试剂盒(W6511，上海华舜生物工程有限公司)进行基因组DNA的提取，提取方法参照试剂盒操作手册，牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的PCR检测方法参照文献。对检出阳性样本目的扩增条带的灰度值进行定量分析(Quantity One分析软件，美国)，用扩增目的条带与DNA分子量标准(DL2 000，宝生物工程大连有限公司)中最接近条带的单位面积内的灰度比值来反映目的基因的相对量定为PCR产物量，未扩增出目的条带样本的产物量记为0 ng。

　　1．4 统计学分析应用SPSS 11．5统计软件，临床指标用均数4-标准差(x±s)表示，有机酸浓度和产物量以中位数(median)和四分位数间距(interquartile range，IQR)表示，计量资料比较采用两个独立样本非参数检验(Mann．Whitney Test)，计数资料比较采用x。检验，有机酸浓度与产物量的关系采用Spearman相关分析，检验水准为双侧仅=0．05。

　　2 结果

　　2．1 两组研究对象取样位点的基本状况AgP组取样位点的临床指标、有机酸浓度、牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的检出率、产物量均显着高于健康对照组(P<0．001)，其中琥珀酸为1．38(0．84，2．03)mmol／L'135．0．33(0．O0，1．47)mmo]．／L、乙酸为26．07(14．15，38．57)mmol／L ．11．35(6．31，16．21)mmol／L、丙酸为8．91(4．15，12．77)mmol／L ．2．07(1．20，3．07)mmol／L、丁酸为2．46(0．89，4．21)mmol／L ．0．O0(0．O0，0．43)mmol／L、异戊酸为2．O0(0．37，3．51)retool／L ．0．00(0．00，0．93)mmol／L，牙龈卟啉单胞菌检出率为93．8％．4．7％ ，牙龈卟啉单胞菌产物量为142(60，198)ng眠0．0(0．0，0．0)ng，齿垢密螺旋体检出率为70％ ．3．1％ ，齿垢密螺旋体产物量为80(0，175)ng粥．0．0(0．0，0．0)ng(表1)2．2 牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体对有机酸浓度的影响AgP组牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体的检出对有机酸浓度的影ninon表2所示，在牙龈卟啉单胞菌检出位点的丁酸浓度显着高于未检出位点[2．87(0．99，4．36)mmol／L ．0．33(0．00，1．44)mmol／L，P=0．013，琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸的浓度在牙龈卟啉单胞菌检出与未检出组间差异无统计学意义。在齿垢密螺旋体检出位点有机酸的浓度均显着高于未检出位点，分别为：琥珀酸1．67(1．15，2．11)retool／L US．0．80(0．48，1．06)mmol／L，乙酸31．95 (23．77．43．13) mmol／L VS．12．51 (7．57。15．69)mmol／L，丙酸l1．86(6．55，14．98)mmol／L． 2．82(1．71，7．03)mmoUL，丁酸3．45(2．41，4．78)mmol／L椰．0．54(0．00，1．56)mmol／L，异戊酸2．2：3(1．05，3．85)mmol／L ．0．62(0．00，2．33)mmol／L，P均<0．05。2．3 有机酸浓度与牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体产物量的关系如表3所示，琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸的浓度与牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的产物量均呈显着正相关，与牙龈卟啉单胞菌产物量的r值分别为0．548、0．334、0．411、0．493(P<0．05)，与齿垢密螺旋体产物量的r值分别为0．702、0．443、0．625、0．557(P<0．05)，异戊酸的浓度仅与牙龈卟啉单胞菌的产物量呈显着正相关(r=0．273，P<0．05)。

       3 讨论牙周致病菌的检测是评价牙周疾病治疗疗效的一种方法，随着PCR技术的不断完善，检测微生物所需要的时间已经大大减少。通过对PCR电泳条带灰度值的定量分析可以在一定程度上反映所测样本的微生物量，与微生物检出率相比，是一种相对客观的评价微生物量的方法，但是此方法不是对样本中微生物起始量的定量分析，仅是对样本中微生物量的估算方法。由于牙周可疑致病菌种类繁多，检测多种微生物成本较高，而有机酸作为微生物的代谢产物，检测简便、客观。有研究已证明AgP患者病变状况与龈沟液中琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸浓度升高有关 ，如果能发现有机酸与牙周可疑致病菌的关系，为微生物检测提供参考，将具有重要的临床应用价值。

　　龈下微生态环境非常复杂，微生物之间、微生物与各种代谢产物(包括有机酸)之间存在着千丝万缕的联系 。 。目前的研究方法尚不能完全模拟龈下微生态的环境，对于其内部复杂的关联尚需要相关研究来探索。本研究对AgP患者同一龈沟液样本中的牙周致病菌与有机酸进行检测，发现在牙龈卟啉单胞菌检出位点丁酸的浓度升高，齿垢密螺旋体检出位点琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸的浓度显着升高，说明龈沟液中有机酸浓度受牙周致病菌的影响较大。进一步分析有机酸浓度与微生物量的关系发现，AgP患者龈沟液的琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸浓度与牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体产物量呈显着正相关，说明有机酸浓度可以反映牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的量，而牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体作为红色复合体微生物与AgP的发生和进展关系密切，在疾病进展位点的检出率增加，所以有机酸浓度在一定程度上也反映着牙周炎的发生与进展。

　　有机酸作为微生物的代谢产物，不仅牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体可以代谢产生，龈下其他多种微生物——包括尚未被培养出来的微生物可能均会产生有机酸，例如口腔中新培养出的Pre—votella histicol代谢产生大量的琥珀酸和乙酸，以及微量的异戊酸和乳酸 ，Peptostreptococcus stomatis代谢产生丙酸、丁酸和异戊酸等。同时，有机酸浓度还受微生物之间相互作用的影响，当牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体共同培养时，两种细菌生长均加速但琥珀酸的量减少。不同生长方式的细菌代谢产生的有机酸也有差别，在胰蛋白培养基上厌氧生长的普氏菌菌株，其悬浮细胞能代谢天冬氨酸生成琥珀酸、乙酸等，而在培养基中的贴壁细胞还能产生异戊酸 。龈下菌斑生物膜在疾病发展变化过程中，相同微生物代谢产生的有机酸的种类和产量有可能不同，所以有机酸作为龈下微生物的代谢产物，可以综合反映整个龈下微生态的变化，如果能发现其浓度与牙周疾病进展的关系，将有较好的应用前景。本研究结果说明，AgP患者龈沟液中琥珀酸、乙酸、丙酸、丁酸浓度与牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的量密切相关，更深层的有机酸与微生物的相互关联以及与其他微生物的作用还需要深入研究。本研究检测并分析了AgP患者同一龈沟液样本中微生物代谢产物有机酸与牙周主要致病菌牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体，发现AgP患者龈沟液中琥珀酸、乙酸、丙酸和丁酸的浓度在一定程度上反映牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体的产物量，有可能作为判断AgP发生与进展的指标。