临床上颈动脉瘤切除手术、颅内动脉瘤手术以及心肺脑复苏过程中均不可避免地会发生脑缺血一再灌注损伤，从而影响了患者的预后。有研究发现，脑缺血一再灌注时，环氧合酶-2(COX一2)表达上调。COX一2可通过激活微粒体前列腺素合成酶一1(mPGEs一1)，促进花生四烯酸代谢为前列腺类物质，从而诱发炎症反应，导致脑缺血一再灌注损伤。有研究 表明，COX抑制剂——氟比洛芬酯可减轻大鼠脑缺血一再灌注损伤。帕瑞昔布钠为特异性COX一2抑制剂，具有镇痛及抗炎等作用，且不影响胃肠道功能，对血小板聚集功能无影响。水通道蛋白(aqu0rins，AQPs)是一类能够对水分子进行高效特异性转运的通道蛋白，广泛分布于生物细胞膜上，而水通道蛋白4(aquaporim4，AQP4)在脑组织中含量最高。有研究证实，AQP4与脑缺血一再灌注损伤密切相关。本研究拟评价帕瑞昔布预先给药对大鼠局灶性脑缺血一再灌注损伤及脑组织AQP4表达的影响。
1 材料与方法
1．1 实验动物及分组选择健康的1O～12周龄雄性SD大鼠108只，体质量250～300(281±11)g。由南昌大学实验动物科学部提供。所有大鼠于南昌大学实验动物科学部IVC笼俱饲养。动物笼俱内温度为(25±2)℃，湿度为(75±2)，24h自动昼夜循环，光照10～12 h·d。动物以不含OVA 的标准饲料及灭菌双蒸水适应性喂养1周后，开始正式实验。将108只大鼠按随机数字表法分为3组：假手术组(S组)、脑缺血一再灌注+帕瑞昔布组(P组)及脑缺血一再灌注组(IR组)，每组36只。
1．2 实验方法
1．2．1 大鼠局灶性脑缺血一再灌注模型的建立及给药方法1)参照文献的线栓法，并进行改良建立局灶性脑缺血～再灌注模型。首先，将P组、IR组大鼠采用1O 水合氯醛400 mg·kg腹腔注射。待大鼠常规消毒皮肤、铺巾。行颈前正中切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。将线栓(直径0．26 mm，长5cm)由颈外动脉置入颈内动脉。然后，插入大脑中动脉。线栓插入深度距颈总动脉分叉处18～20mm，至有阻力不能再进为止，结扎颈内动脉(模型建立过程中用烤灯照射，维持大鼠肛温36．5～37．5℃)。缺血2h后，恢复再灌注。再灌注后2、24 h，只须将线栓抽至颈内动脉起始部，恢复大脑中动脉血供。2组动物模型均建立成功，模型建立成功后，P组在缺血前15 min经尾静脉注射帕瑞昔布钠(美国Pfizer公司，批号：01082013)10 mg·kg，IR组在缺血前15 min经尾静脉注射等容量生理盐水。2)S组只分离、结扎右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，不置入线栓，不作任何处理。缺血2 h后，恢复再灌注。再灌注后2-24 h，并恢复大脑中动脉血供。
1．2．2 神经功能缺陷评分分别于再灌注后2、24 h时对各组大鼠进行神经功能缺陷评分(NDS评分)，并参照文献的标准进行评分。0分：无症状；1分：提尾时对侧前肢不能伸直；2分：行走时向对侧旋转；3分：行走时向对侧倾倒；4分：无自发活动，意识丧失。
1．2．3 脑梗死体积及其百分比率的测定分别于再灌注后2、24 h时每组随机选取6只大鼠，采用水合氯醛400 mg·kg 腹腔注射。
麻醉后，迅速断头取脑。去除嗅球、小脑及低位脑干后，置于一2O℃ 冰箱保存，备用。将所取标本放于脑模具上行冠状片切成5片，每片厚度为2 mm，一三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃ 染色2O min。再置于4 多聚甲醛固定。固定后，采用Leica图像分析系统(德国徕卡仪器有限公司)分析，计算脑梗死体积及其百分比率。
1．2．4 脑组织含水量的测定分别于再灌注后2、24 h时每组随机选取6只大鼠，采用10 水合氯醛400 mg·kg腹腔注射。
麻醉后，迅速断头取脑。用滤纸吸干大脑表面水分和血液，取大脑半球放人已干燥至恒重的培养皿上，用JAlOO3电子天平称(上海天平仪器厂)称其湿重。然后，将其放入202—00型电热恒温干燥箱(西安明克斯检测设备有限公司)中以120。C烘干，直至称量的2次重量差<1 湿重，则最后1次重量为干重。按文献的公式计算脑组织含水量，脑组织含水量一(湿重一干重)／湿重×1O0%。
I．2．5 脑组织中AQP4表达水平的测定采用免疫组织化学染色法测定脑组织中AQP4表达水平。分别于再灌注后2、24 h时每组随机选取6只大鼠，采用1O 水合氯醛400 mg·kg 腹腔注射。麻醉后，开胸，暴露心脏，经升主动脉依次灌注4％多聚甲醛和生理盐水。断头取脑，4 多聚甲醛固定、漂洗、脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡至水，滴加3 过氧化氢溶液浸泡30 min。PBS冲洗，加入兔抗大鼠AQP4抗体(1：200，武汉博士德生物工程有限公司)。PBS冲洗，加入二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，用DAB显色液显色。显色后，以PBS清洗终止显色反应。滴加1 苏木精复染，漂洗5 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。
每张切片在400倍CX21光学显微镜(日本Olym—pus公司)下随机取5个视野，采用Image Pro—Plus4．5图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)计算AQP4表达的积分吸光度平均值，以积分吸光度平均值表示AQP4表达量。
1．3 统计学方法采用SPSS19．0统计学软件对数据进行分析。计量资料以 ±S表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0．05为差异有统计学意义。
2 结果2．1 3组NDS评分的比较与S组比较，IR组、P组大鼠再灌注后2、24 h时NDS评分均升高(均P<O．05)；与IR组比较，P组大鼠再灌注后2、24 h时NDS评分均降低(P<0．05)。
2．2 3组脑梗死体积及其百分比率的比较S组再灌注后2、24 h时未观察到脑梗死灶。
与s组比较，IR组、P组大鼠再灌注后2、24 h时脑梗死体积增大、脑梗死体积百分比率均升高(均P<0．05)；与IR组比较，P组大鼠再灌注后2、24 h时脑梗死体积缩小、脑梗死体积百分比率均降低(均P<0．05)。
2．3 3组脑组织含水量的比较与s组比较，IR组大鼠再灌注后2、24 h时脑组织含水量均升高(均P<0．05)；与IR组比较，P组大鼠再灌注后2、24 h时脑组织含水量均降低(均P<0．05)。
．4 3组脑组织中AQP4表达水平的比较与S组比较，IR组再灌注后2、24 h时脑组织中AQP4表达水平均升高(均P<0．05)；与IR组比较，P组再灌注后2、24 h时脑组织中AQP4表达水平均降低(均P<0．05)。
3 讨论线栓法是常用的制备大鼠局灶性脑缺血模型的方法，可模拟临床上大脑中动脉供血中断。因此，本研究参照文献的线栓法，并进行改良建立局灶性脑缺血一再灌注损伤模型。有研究表明，脑缺血后2 h再灌注，于再灌注后24 h时脑梗死体积增大。
因此，本研究观察至再灌注后24h。本研究结果显示，与S组比较，IR组大鼠再灌注后2、24 h时NDS评分均升高(均P<0．05)，IR组大鼠再灌注后2、24 h时脑梗死体积增大、脑梗死体积百分比率均升高(均P<0．05)。提示，脑缺血一再灌注损伤模型建立成功。
帕瑞昔布钠为首个可同时采用静脉和肌内注射形式给药的选择性COX-2抑制剂，其本身没有抑制c0X—l和COX一2的作用，但其在静脉注射后可被酶水解，迅速转变成伐地昔布，是伐地昔布的前体，其在体内首先生成伐地昔布，而起作用。伐地昔布是高选择性COX一2抑制剂，约15 rain起效，而达峰值。因此，本研究选择在脑缺血前15min静脉注射帕瑞昔布钠。另外，本研究参照文献选择帕瑞昔布钠剂量，1O mg·kg 静脉注射，可避免腹腔注射或肌内注射吸收不完全。大鼠局灶性脑缺血～再灌注损伤时，帕瑞昔布钠可通过血一脑屏障，发挥脑保护作用 。本研究结果显示，与IR组比较，P组神经功能缺陷评分、脑组织含水量降低及脑梗死体积缩小(P<O．05)。提示，脑缺血前15 min静脉预先注射帕瑞昔布钠10 mg·kg 可减轻大鼠脑缺血一再灌注损伤。
水通道蛋白是一类介导水分子快速跨膜转运的细胞膜蛋白，其对维持机体的体液平衡和内环境的稳态有重要的作用。其中AQP4在脑组织中含量最高，广泛分布于星形胶质细胞、脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜、脉络丛、下丘脑的视上核和视旁核等。有研究。 证实，AQP4与多种神经系统疾病引起的脑水肿密切相关，并参与脑水肿的形成与消退。本研究结果显示，与S组比较，IR组大鼠再灌注后2、24 h时脑梗死体积增大、脑梗死体积百分比率、脑组织含水量及脑组织中AQP4表达水平均升高(均P<0．05)。提示，脑缺血一再灌注后大鼠脑组织中AQP4表达明显升高，并与脑梗死体积、脑水肿改变一致，且AQP4表达升高是脑缺血一再灌注后脑水肿形成的主要原因之一。
本研究结果显示，与IR组比较，P组大鼠再灌注后2、24 h时脑组织含水量、脑组织中AQP4表达水平均降低(均P<0．05)。提示，帕瑞昔布预先给药可减轻大鼠局灶性脑缺血一再灌注损伤，其机制与下调AQP4表达从而减轻脑水肿有关。
COX一2是炎症反应过程中的重要因子，抑制COX一2过度表达和激活是治疗炎症最有效的手段之一。有研究发现，大鼠脑缺血一再灌注损伤后，脑组织内的COX-2mRNA及C0X一2蛋白含量明显增加。帕瑞昔布钠为选择性cOX一2抑制剂，可抑制全身炎症反应，抑制脑组织CoX一2 mRNA及CoX一2蛋白表达。减少氧自由基释放，减轻血管内皮损伤，维持血一脑屏障的完整性，从而下调AQP4的表达，减轻脑水肿。
综上所述，帕瑞昔布预先给药可减轻大鼠局灶性脑缺血一再灌注损伤，其机制与下调AQP4表达从而减轻脑水肿有关。
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