机体烧伤后，可诱发全身炎症反应综合征，导致急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)的发生，严重时会发展到急性呼吸窘迫综合征，甚至并发多器官功能障碍综合征。中性粒细胞(poly—morphonuclearneutrophil，PMN)是参与肺急性炎症的主要效应细胞¨，在炎症局部被过度激活、延迟清除，释放过量的氧自由基和蛋白水解酶及其他有害物质而加重炎症反应和组织损伤。凋亡的PMN不仅脱颗粒、吞噬等功能减弱，而且更易被吞噬细胞识别而清除。在烧伤时PMN大量扣押，生存时问延长，这种变化与炎症部位多种炎症细胞因子对PMN凋亡的延迟作用有直接关系。本研究通过制作烧伤兔ALl模型，探讨PMN凋亡在Au发病中的作用。
1材料与方法
1．1主要材料健康新西兰大白兔36只(蚌埠医学院实验动物巾心提供)，清洁级，雌雄各半，体重2～3kg；DMEM培养基(Gibco公司)；Histopaque1119、Histopaque1083(Sigma公司)；Annexin—V—FLUOS(Roche公司)；碘化丙啶(propidiumiodide，PI，Sigma公司)；二氢罗得明123(DHR123，Sigma公刮)；佛波酯(phorbol12-1nyristate13一acetate，PMA，Sigma原装)。细胞捌亡流式细胞仪(BD公司)检洲住蚌埠医学院科研中心进行。
1．2动物分组及模型制备适应性喂养1～2周后，实验前后不禁食水，称重编号，随机分为对照组6只和烧伤组30只。烧伤组又随机分为5个亚组，每组6只，红烧伤后2、4、8、12、24h处死大兔。烧伤兔川20％I托坦(5ml／kg)，耳缘静脉注射，允分麻醉后固定于兔台上取较大的聚乙烯垫片作为防护片，中问按总体表秋的30％做一椭圆形的洲，住兔予一匕部，使烫伤露出灾持尤纱布蘸取8％硫化钠脱毛，冲洗净，擦干。将实验兔背部脱毛区皮肤浸于100℃沸水中(水温汁测定水湍)，持续12s，造成实验兔背部30％体表深Ⅲ度烧伤观察创面，表苍白、质硬、尢渗出，烧伤深度经痫实，实验兔烧伤模型即复制成功对照照组仪背部脱毛37℃水浸浴。
1．3标本采集按实验预定时间处夕匕动物，分离气僻胸取肺，0找气管分义处，结扎右侧十支僻，左侧竹插管，用火菌后的DMEM培养20ml钳插管注入肺，在肺内停留2min后用注射器抽出，放r尤菌试管待榆，灌洗2次，回收率达70％以上。同时右侧猪支气管结扎后立即从右肺上叶取一块肺组织迅速放入10％中性甲醛溶液中固定24h，然后进行石蜡包埋HE染色观察肺损伤的程度．采用Smilh评分方法对肺水肿、肺泡及间质炎症。肺泡及间质出血。肺不张合透明膜形成，进行0-4分半定亮分析，无损伤为0分，病变范围<25％为1分，病变范围占>25％～50％为2分，病变范围>50％～75％为3分；病变满视野为4分，总肺损伤评分为上述各项之和。每只动物观察10个离倍视野，取其平均值。取右肺吸水纸吸1发面水分及血液后称湿重。置于80℃烤箱72h后，称量肺干重，计算湿干重之比(W／1))。
1．4PMN的分离把收集好的肺泡灌洗液，离心沉淀后用DMEM培养1ml重新悬浮，后用Histopaque1119及Histopaque1083各 2ml，进行密度梯度离心(700r／rain)30min，吸取Histopaque1119和Histopaque1083之间的PMN富集层后，用2m1的DMEM电新悬浮，离心(4℃，1500r／min)10min，按上述方法再洗l遍用无菌注射用水1ml低渗溶解红细胞，30s后迅速加入人等量的1．8％的盐水使之等渗。后加入DMEM2mI离心(4，1500r／min)10min弃清后用0．5ml培养基悬浮。瑞氏一姬姆萨染色，确定PMN纯度>90％，并计数PMN数量。调浓度为1×106／ml待检。
1．5肺泡灌洗液PMN凋亡和坏死细胞定量川AnnexinV和PI双标法，分离纯化的PMN悬浮于100txl孵育缓冲液中(10miilolHepes，140ilnnolNaCI5IllnlolCaCI2，pH值为7．4)，加入2ul AnneexinV—FLUOS和2ulpl(50mg／l)，室温l0～15min，加0．4ml孵育缓冲液终止反应，流式细胞仪蚁迎道检测5000个细胞，激发波长488nm，发射波长515nm和610nm。AnnexinV阳性为凋亡早期细胞，PI阳性为坏死细胞，AmtoxinV、P1蚁双阳性晚期／坏死细胞。
1．6肺泡灌洗液PMN呼吸爆发的测定80ulPMN悬液中加入20ulHRl23(10umol／l，37℃孵育5min，加入PMA(500nmol／1)2ul刺激10min，流细胞仪单通道检测5000个胞激发波长488nm’发射波长510～550nm，结以均迎道佚光强(LnMCF）表示。
1．7统计学方法采用分析和q检验。
2.结果
2．1肺组织病理和肺水含量 对照组肺泡结构完整，肺泡腔内清晰，避光滑，肺泡腔及间质内无渗出；烧伤组各时相点肺组织标本颜色略苍白，可见双肺散在或点片状出血，以肺上叶和肺门处为著，均可见到肺泡腔及间质内白细胞渗出、l无统计学意义(P>0．05)，比较异均有统计学意义(p<0．05～P<0．01)烧肿W／I)也随延长升l(p<0．01)，8IiJj埘照组(P<0．O1)．
2．2肺泡灌洗液中PMN调亡、坏死、存活细胞及PMN呼吸爆发的变化免烧伤2～12h，PMN凋亡率著降低(P<0．05～p<0．01）
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