氨磷汀(amifostine，WR-2721)是一种细胞保护剂，对正常组织具有保护作用。但是WR一2721在一定的剂量时也具有一定的毒性作用 ，临床上WR-2721的主要不良反应为低血压、过敏性皮疹、发热、休克和血钙降低等。笔者的前期实验研究表明，多糖能减少WR-2721对体外细胞造成的毒性本实验采用MTI法检测细胞的存活率，采用比色法测定细胞丙二醛(mal0nyldialdehyde，MDA)含量，流式细胞术检测细胞凋亡，以观察香菇多糖与WR一2721联合应用对Hela细胞的影响。

 

　　1 材料与方法

 

　　1．1 实验材料Hela细胞株，由本院提供；香菇多糖，湖北创力药业有限公司产品；WR一2721，湖北葛店人福药业有限公司产品；DMEM(dulbecco S minimum essentialmedium)培养基，美国GIBCO公司产品；小牛血清，杭州四季青生物工程公司产品；MTI，PI，Sigma公司产品；MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所研制；Triton X．100，Amerseo公司产品。

 

　　1．2 实验方法

 

　　1．2．1 细胞培养Hela细胞培养于含10％小牛血清DMEM培养基中，在37℃ ，5％ CO2、饱和湿度的培养箱中培养至对数生长期。

 

　　1．2．2 香菇多糖对Hela细胞生长的影响取对数生长期Hela细胞(3 X 10 ／m1)，接种于96孔培养板中，置37 oC，5％ CO：、饱和湿度的培养箱中培养12 h，加入香菇多糖溶液，终浓度分别为0、25、125、250、500、1000、2000 mg／I~，每个浓度设4个孔，继续培养48 h。小心弃去上层培养液，加入150 l以DMEM培养基配制的MTr溶液继续培养4 h，弃去上层培养液，加入150 l DMSO，振荡10 min，用酶标仪在570 nm处测定OD值。按下列公式计算细胞存活率。

 

　　细胞存活率(％)：(实验组OD值／对照组OD值)X 100％

 

　　1．2．3 香菇多糖对WR-2721处理的Hela细胞生长的影响细胞处理方法同

　　1．2．2，设空白对照组、WR一2721组、香菇多糖+WR．2721联合给药组。

 

　　WR-2721终浓度为500 mg／L，香菇多糖的终浓度分别为0、25、125、250、500、10O0、2000 mg／L。

 

　　1．2．4 香菇多糖对WR-2721处理的Hela细胞MDA的影响取对数生长期的Hela细胞，用DMEM培养液调至3 X 10 ／ml，接种于6孔培养板中。置37℃ ，5％ CO 、饱和湿度的培养箱中培养12～16 h，设空白对照组、WR-2721组及香菇多糖+WR-2721联合给药组，WR-2721终浓度为500 mg／L，香菇多糖终浓度分别为50、200、1000 mg／L，每个浓度设4个孑L。

 

　　继续培养48 h，用1．5 ml PBS吹打制成细胞悬液移人离心管，反复冻融3次，用超声细胞破碎仪在冰浴中完全破碎细胞(20 kHz，10 min)，4℃离心，取上清液，按试剂盒说明书测定MDA含量。

 

　　1．2．5 香菇多糖对WR．2721处理的Hela细胞凋亡的影响 取对数生长期的Hela细胞，以5×10 ／rnl的密度接种，培养16 h后，设空白对照组、WR一2721组和香菇多糖+WR-2721联合给药组，WR-2721终浓度为500 mg／l，香菇多糖终浓度为125、1000 mg／L，继续培养48 h，胰酶消化成单细胞悬液，用冰PBS洗涤2次，800 r／min离心5 min，离心半径为85 mm，弃上清，缓慢加入一20~C预冷的70％ 乙醇，4℃过夜。

 

　　取细胞悬液，PBS洗涤，1600 r／min离心5 min后，弃上清。PI染色液1 ml染色30 min，混合液经过300目滤网以除去杂质，流式细胞术测定细胞的凋亡率。

 

　　1．3 统计学处理所有检测结果以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS 17．0软件，对结果进行t检验。P<0．05为差异有统计学意义。

 

　　2 结果

 

　　2．1 香菇多糖对Hela细胞生长的影响与空白对照组(多糖剂量为0)比较，各浓度的香菇多糖组差异均无统计学意义(P>0．05)，提示香菇多糖对Hela细胞无明显不良作用。

 

　　2．2 香菇多糖对WR-2721处理的Hela细胞生长的影响WR．2721处理组He]a细胞存活率为41．4％，香菇多糖在1000、2000 mg／L时，Hela细胞存活率分别为63．O％和58．5％ ，与WR-2721组比较均非常显着升高，差异有统计学意义(P<0．01)。提示高浓度香菇多糖对WR-2721的细胞毒性有显着的防护作用。

 

　　2．3 香菇多糖对WR-2721处理的Hela细胞MDA的影响不同浓度的香菇多糖溶液与WR．2721联合应用，与空白对照组及单用WR-2721组比较，细胞MDA差异无统计学意义(P>0．05)。提示香菇多糖、WR-2721及两者联合应用对Hela细胞的MDA含量均无明显影响。

 

　　2．4 香菇多糖对WR．2721处理的Hela细胞凋亡的影响WR．2721处理后Hela细胞的凋亡率明显增加；不同浓度香菇多糖处理组细胞的凋亡率均明显低于WR．2721组，差异均有统计学意义(P<0．01)。提示香菇多糖能抑制WR．2721引起的Hela细胞凋亡。

 

　　3 讨论WR．2721是一种辐射损伤防护剂，在临床上主要用于辐射损伤的治疗，也用作化疗、放疗的保护剂，但WR-2721本身有较强的毒性作用。本研究发现，以终浓度为500 mg／L的WR-2721处理Hela细胞后，细胞存活率下降至41．4％ ，凋亡率达27．5％，与对照组比较差异有统计学意义，说明一定浓度的WR．272 1对细胞有毒性作用。

 

　　国内外大量研究表明，电离辐射可以诱导细胞发生凋亡和氧化损伤 。MDA是氧化损伤的经典指标，机体通过非酶系统作用于生物膜中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，生成大量的代谢产物MDA，常用MDA来反映组织脂质过氧化损伤的程度，也用来评价辐射防护药物对机体的保护作用。本研究显示，香菇多糖、WR．2721单用及两者联合应用均不会引起细胞产生脂质过氧化反应。

 

　　细胞凋亡在维持组织正常形态及功能方面起重要作用。香菇多糖浓度为125～1000 mg／L时，与wR．2721联合使用后，其凋亡率最低达19．8％，显示香菇多糖可显着减少WR一2721所致的Hela细胞凋亡，说明一定浓度的wR-2721对体外培养细胞具有明显的毒性，香菇多糖对WR．2721造成的细胞毒性具有防护作用。

 

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